Avainero – Geenikloonaus vs. PCR
Monien DNA-kopioiden synteesiä tietystä DNA-fragmentista kutsutaan DNA-amplifikaatioksi. On olemassa kaksi pääasiallista DNA:n monistusprosessia, nimittäin geenikloonaus ja PCR. Keskeinen ero geenikloonauksen ja PCR:n välillä on, että geenikloonaus tuottaa useita kopioita tietystä geenistä in vivo rakentamalla rekombinantti-DNA:n ja kasvamalla isäntäbakteerin sisällä, kun taas PCR tuottaa miljoonia kopioita spesifisestä DNA-fragmentista in vitro käyden läpi toistuvia denaturaatio ja synteesi.
Mitä on geenikloonaus?
Geenikloonaus on tekniikka, jota käytetään tietyn geenin paikallistamiseksi ja lisäämiseksi organismin erotetusta genomisesta DNA:sta rakentamalla yhdistelmä-DNA:ta. Genominen DNA sisältää tuhansia erilaisia proteiineille koodattuja geenejä. Kun DNA uutetaan, se sisältää kaikki mahdolliset geenit, joita se voi kantaa. Geenikloonaustekniikka on mahdollistanut tietyn geenin havaitsemisen kokonais-DNA:sta. Siksi geenikloonaus toimii tärkeänä työkaluna molekyylibiologiassa.
Organistisen genomisen kirjaston tekeminen on välttämätöntä geenikloonauksessa, jos ei ole aavistustakaan kyseisen geenin sijainnista DNA:ssa. Genomikirjasto tehdään seuraavien vaiheiden avulla.
Vaihe 1: Kokonais-DNA:n uuttaminen organismista, joka sisältää halutun geenin.
Vaihe 2: Uutetun DNA:n restriktiohajotus pienten hallittavissa olevien fragmenttien tuottamiseksi. Tätä vaihetta helpottavat restriktioendonukleaasit.
Vaihe 3: Sopivan vektorin valinta ja vektori-DNA:n avaaminen käyttämällä samoja restriktioendonukleaaseja. Bakteeriplasmideja käytetään yleisesti vektoreina vieraan DNA:n kuljettamiseen. Plasmidit ovat pieniä DNA-renkaita, jotka sijaitsevat bakteereissa.
Vaihe 4: Vektorin DNA:n ja fragmentoidun DNA:n yhdistäminen rekombinantti-DNA-molekyylin tuottamiseksi. Tätä vaihetta hallitsee DNA-ligaasi.
Vaihe 5: Rekombinantti-DNA-molekyylien siirto isäntäbakteereihin. Tätä vaihetta kutsutaan muunnokseksi, ja se tehdään lämpöshokin avulla.
Vaihe 5: Transformoituneiden bakteerisolujen seulonta viljelyalustalla. Transformoituneiden ja transformoimattomien isäntäsolujen sekapopulaatio saadaan transformaatioprosessin lopussa. Koska kiinnostava geeni sisältää vain transformoidut isäntäsolut. Siksi on välttämätöntä valita transformoidut solut. Valinta tehdään selektiivisellä elatusaineella, joka sisältää antibiootteja. Vain transformoidut solut kasvavat tällä seulontaalustalla, mikä mahdollistaa valinnan.
Vaihe 6: Bakteerien kasvattaminen geenikirjaston tuottamiseksi. Tässä vaiheessa transformoidut isäntäsolut viedään tuoreeseen elatusaineeseen, joka tarjoaa optimaaliset kasvuvaatimukset. Viljelylevyillä olevat pesäkkeet edustavat kyseisen organismin genomista kirjastoa.
Vaihe 7: Kiinnostuksen kohteena olevan geenin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli on seulottava tuhansista kloonatuista yhdistelmä-DNA:n fragmenteista. Se voidaan saavuttaa käyttämällä koettimia, jotka merkitsevät tietyn geenin tai spesifisen proteiinin tulokset siitä geenistä.
Kun bakteeripesäkkeen sisältävä kiinnostunut geeni on tunnistettu kaikista pesäkkeistä, on mahdollista tehdä miljoonia kopioita geenin sisältävästä rekombinanttiplasmidista.
Geenikloonausta käytetään geenikirjastojen perustamiseen, erityisten proteiinien, vitamiinien, antibioottien, hormonien tuottamiseen, organismien genomien sekvensointiin ja kartoittamiseen, yksilöiden DNA:n monien kopioiden tekemiseen oikeuslääketieteessä jne.
Kuva_1: Geenikloonaus
Mikä on PCR?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on tekniikka, joka tuottaa suuren määrän kopioita tietystä DNA-fragmentista. Spesifisen DNA-sekvenssin eksponentiaalinen monistuminen saadaan PCR:llä in vitro -olosuhteissa. Tämä tekniikka on erittäin tehokas työkalu molekyylibiologiassa, koska sillä voidaan moninkertaistaa pieni DNA-näyte käyttökelpoiseksi määräksi. Kary Mullis esitteli PCR:n vuonna 1983, ja tämä palkittu keksintö loi v altavan edistyksen molekyylibiologiassa.
PCR-tekniikka seuraa toistuvia PCR-reaktioita, kuten kuvassa 02 on esitetty. Yksi PCR-reaktio koostuu kolmesta päävaiheesta, jotka tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa; kaksijuosteisen DNA:n denaturointi 94 °C:ssa 0C, alukkeiden pariuttaminen 68 °C:ssa 0C ja juosteen pidennys 72 °C:ssa 0 C. Siksi, kun PCR suoritetaan, lämpötilan vaihtelua tulisi ylläpitää erittäin korkealla oikean replikoinnin varmistamiseksi. PCR suoritetaan PCR-koneessa PCR-putkien sisällä. PCR-putkiin ladataan oikeita PCR-seoksia, jotka sisältävät templaatti-DNA:ta, Taq-polymeraasia, alukkeita, dNTP:itä ja puskuria. Kaksijuosteisen näyte-DNA:n denaturointi yksijuosteiseksi DNA:ksi tehdään katkaisemalla komplementaaristen emästen väliset vetysidokset lämpötilassa 94-98 0C. Sitten yksittäiset templaatti-DNA:n juosteet paljastetaan alukkeita varten. Mukana tulee olla pari alukkeita (eteenpäin ja taaksepäin), ja niiden tulee olla lämpöstabiileja sietääkseen korkeita lämpötiloja. Alukkeet ovat yksijuosteisia lyhyitä DNA-sekvenssejä, jotka ovat komplementaarisia kohde-DNA-fragmentin päille. PCR:ssä käytetään synteettisiä alukkeita. Alukkeet sitoutuvat näyte-DNA:n komplementaarisiin emäksiin ja käynnistävät uuden juosteen synteesin. Tätä vaihetta katalysoi entsyymi nimeltä Taq-polymeraasi; lämpöstabiili DNA-polymeraasientsyymi, joka on eristetty Thermus auqaticuksesta. Kun alukkeita ja nukleotideja (rakennuspalikoita) on saatavilla, Taq-polymeraasi rakentaa uuden DNA-juosteen, joka on komplementaarinen templaatti-DNA:lle. PCR-ohjelman lopussa monistettu DNA-fragmentti tarkkaillaan käyttämällä geelielektroforeesia. Jos lisäanalyysiä tarvitaan, PCR-tuote puhdistetaan geelistä.
PCR on erittäin hyödyllinen geneettisten ja hankittujen sairauksien diagnosointiin ja seurantaan, rikollisten tunnistamiseen (rikoslääketieteen alalla), kohdennetun DNA-segmentin rakenteen ja toiminnan tutkimiseen, organismien genomien sekvensointiin ja kartoitukseen, jne. PCR:stä on tullut rutiinilaboratoriotekniikka lääketieteen ja molekyylibiologian tutkimuslaboratorioissa tutkijoiden keskuudessa, koska sillä on laaja valikoima sovelluksia.
Kuva_2: Polymeraasiketjureaktio
Mitä eroa on geenikloonauksen ja PCR:n välillä?
Geenikloonaus vs PCR |
|
| Geenikloonaus on prosessi, jossa tehdään useita kopioita tietystä geenistä in vivo yhdistelmä-DNA:n kautta ja transformoidaan isäntäbakteeriksi. | PCR-tekniikka tuottaa useita kopioita tietystä DNA-sekvenssistä in vitro toistuvien PCR-reaktiojaksojen kautta. |
| Rekombinantti-DNA:n rakentamisen vaatimus | |
| Rekombinantti-DNA:ta tuotetaan geenin paikantamiseksi. | Yhdistelmä-DNA:ta ei tuoteta. |
| Työvoiman tarve | |
| Tämä prosessi on työvoimav altainen. | Intensiivistä työtä ei tarvita. |
| In vivo- tai In vitro -prosessi | |
| Yhdistelmä-DNA:n rakentaminen on in vitro ja DNA:n monistus in vivo. | DNA:n monistuminen tapahtuu täysin in vitro. |
Yhteenveto – Geenikloonaus vs. PCR
Geenikloonaus ja PCR ovat kaksi DNA:n monistamiseen käytettyä menetelmää. PCR on in vitro -prosessi, joka tekee useita kopioita tietyn DNA-fragmentin DNA:sta ilman rekombinantti-DNA:ta ja isäntäorganismia. Geenikloonaus on ensisijaisesti in vivo -prosessi, joka tuottaa useita kopioita kiinnostuneesta geenistä isäntäorganismin sisällä yhdistelmä-DNA:n rakentamisen kautta. Tämä on ero geenikloonauksen ja PCR:n välillä.
