Avainero – PCR vs DNA:n replikaatio
DNA:n replikaatio on luonnollinen prosessi, joka tapahtuu elävissä organismeissa. Se sisältää kahden identtisen kopion tuottamisen yhdestä DNA-molekyylistä. DNA:n replikaatio on erittäin tärkeä biologisen perinnön prosessi. Geneettinen tieto siirtyy vanhemmilta jälkeläisille pääasiassa DNA:n replikaatiokyvyn vuoksi. Siksi se on olennainen prosessi, jota esiintyy melkein kaikissa elävissä organismeissa. Tämä prosessi tapahtuu in vivo. DNA-replikaatio voidaan kuitenkin tehdä myös in vitro -menetelmillä. Polymeraasiketjureaktio (PCR) on yksi tällainen DNA-replikaatiomenetelmä in vitro. PCR on laboratorioissa suoritettava DNA:n monistusmenetelmä. Se tuottaa tuhansia tai miljoonia kopioita DNA:sta kiinnostuneesta DNA-fragmentista tai geenistä. In vivo DNA-replikaation ja PCR:n välillä on eroja. Keskeinen ero näiden kahden välillä on se, että PCR suoritetaan PCR-koneessa ylläpidetyissä lämpötiloissa suuren määrän DNA-kopioiden tuottamiseksi, kun taas DNA:n replikaatio tapahtuu kehon sisällä kehon lämpötilassa, jolloin saadaan kaksi identtistä kopiota yhdestä DNA-molekyylistä.
Mikä on PCR?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on in vitro DNA:n monistustekniikka, jota suoritetaan rutiininomaisesti molekyylibiologisissa laboratorioissa. Tämä menetelmä mahdollisti tuhansien tai miljoonien kopioiden valmistamisen erityisen kiinnostuneesta DNA-fragmentista. Kary Mullis esitteli PCR:n vuonna 1980. Tässä tekniikassa kiinnostunut DNA-fragmentti toimii templaattina kopioiden tekemiseen. Taq-polymeraasi-nimistä entsyymiä käytetään DNA-polymeraasientsyyminä, ja se katalysoi DNA-fragmentin uusien juosteiden synteesiä. PCR-seoksessa olevat alukkeet toimivat fragmenttien pidennysten lähtöpisteinä. PCR-reaktion lopussa voidaan saada useita kopioita näyte-DNA:sta.
Kaikki DNA-kopioiden tekemiseen tarvittavat ainesosat sisältyvät PCR-seokseen. Ne ovat näyte-DNA, DNA-polymeraasi (Taq-polymeraasi), alukkeet (forward- ja reverse-alukkeet), nukleotidit (DNA:n rakennuspalikoita) ja puskuri. PCR-reaktio suoritetaan PCR-koneessa, ja siihen tulee syöttää oikea PCR-seos ja oikea PCR-ohjelma. Jos reaktioseos ja ohjelma ovat oikein, se tuottaa tarvittavan määrän kopioita tietystä DNA-osasta hyvin pienestä DNA-määrästä.
PCR-reaktiossa on kolme päävaihetta, nimittäin denaturaatio, alukkeen pariutuminen ja juosteen pidentäminen. Nämä kolme vaihetta tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa. DNA on olemassa kaksijuosteisena heliksinä. Kaksi juostetta on sidottu vetysidoksilla. Ennen monistusta kaksijuosteinen DNA erotetaan antamalla korkea lämpötila. Korkeassa lämpötilassa kaksijuosteinen DNA denaturoitui yksittäisiksi juosteiksi. Sitten alukkeet pariutuvat kiinnostuneen fragmentin tai DNA:n geenin viereisten päiden kanssa. Aluke on lyhyt yksijuosteisen DNA:n pala, joka on komplementaarinen kohdesekvenssin päille. Forward- ja reverse-alukkeet pariutuvat komplementaaristen emästen kanssa denaturoidun näyte-DNA:n viereisissä päissä pariutumislämpötilassa.
Kun alukkeita yhdistetään DNA:n kanssa, Taq-polymeraasientsyymi aloittaa uusien juosteiden synteesin lisäämällä nukleotideja, jotka ovat komplementaarisia templaatti-DNA:n kanssa. Taq-polymeraasi on lämpöstabiili entsyymi, joka on eristetty termofiilisestä bakteerista nimeltä Thermus aquaticus. PCR-puskuri ylläpitää optimaaliset olosuhteet Taq-polymeraasitoiminnalle. Nämä kolme PCR-reaktion vaihetta toistetaan tarvittavan määrän PCR-tuotetta tuottamiseksi. Jokaisessa PCR-reaktiossa DNA-kopion määrä kaksinkertaistuu. Tästä syystä PCR:ssä voidaan havaita eksponentiaalinen monistuminen. PCR-tuotetta voidaan tarkkailla geelielektroforeesilla, koska se tuottaa näkyvän määrän DNA:ta geelissä ja se voidaan puhdistaa lisätutkimuksia, kuten sekvensointia varten, jne.
Kuva 01: PCR
PCR on arvokas työkalu lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. Erityisesti oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa PCR:llä on v altava arvo, sillä se voi monistaa DNA:ta rikollisten pienistä näytteistä tutkimuksia varten ja tehdä rikosteknisiä DNA-profiileja. PCR:ää käytetään laaj alti monilla molekyylibiologian alueilla, mukaan lukien genotyypit, geenikloonaus, mutaatioiden havaitseminen, DNA-sekvensointi, DNA-mikrosirut ja isyystestaukset jne.
Mikä on DNA:n replikaatio?
DNA:n replikaatiolla tarkoitetaan prosessia, joka tuottaa kaksi identtistä DNA-kopiota yhdestä DNA-molekyylistä. Se on tärkeä biologisen perinnön prosessi. DNA:n replikaatiota tapahtuu kaikissa elävissä organismeissa. Emosolun genomi tulisi replikoida genomin siirtämiseksi tytärsoluun. DNA:n replikaatioprosessissa on kolme päävaihetta, joita kutsutaan aloitukseksi, elongaatioksi ja lopettamiseksi. Eri entsyymit katalysoivat näitä vaiheita. DNA:n replikaatio alkaa paikasta, jota kutsutaan replikaation aloituspisteeksi solujen genomissa. Genomissa DNA esiintyy kaksijuosteisessa muodossa. Nämä kaksi juostetta erotetaan DNA-replikaation alussa, ja sen tekee ATP-riippuvainen DNA-helikaasi. DNA:n purkaminen on päätapahtuma, joka tapahtuu aloitusvaiheessa. Käyttämällä templaatteina erotettuja DNA-säikeitä, DNA-polymeraasi syntetisoi templaattisäikeiden uudet komplementaariset juosteet 5'-3'-suunnassa. Tätä vaihetta kutsutaan pidennykseksi. Lopetus tapahtuu, kun kaksi replikaatiohaarukkaa kohtaavat toistensa vanhemman kromosomin vastakkaisessa päässä.
Kuva 02: DNA:n replikaatio
DNA-polymeraasin lisäksi useat entsyymit, kuten DNA-primaasi, DNA-helikaasi, DNA-ligaasi ja topoisomeraasi, osallistuvat DNA:n replikaatioon. In vivo DNA:n replikaation erityispiirre on, että se tuottaa Okazaki-fragmentteja. Yksi säie muodostuu jatkuvasti, kun taas toinen muodostuu pieniksi paloiksi.
Mitä yhtäläisyyksiä PCR:n ja DNA:n replikaation välillä on?
- Sekä PCR:ssä että DNA:n replikaatiossa kaksijuosteinen DNA erotetaan toisistaan.
- Sekä PCR- että DNA-replikaatioprosesseissa DNA kopioidaan.
- Sekä PCR- että DNA-replikaatioprosessit ovat todella tärkeitä.
- DNA-polymeraasientsyymi on mukana sekä PCR- että DNA-replikaatioprosesseissa.
Mitä eroa on PCR:n ja DNA:n replikaation välillä?
PCR vs DNA:n replikaatio |
|
| PCR on DNA:n monistamisen in vitro -menetelmä, jossa tuotetaan tuhansia tai miljoonia DNA-kopioita. | DNA:n replikaatio on luonnollinen prosessi, joka tuottaa kaksi identtistä DNA-kopiota yhdestä DNA-molekyylistä. |
| Vaiheet | |
| PCR:ssä on kolme vaihetta; denaturointi, alukkeen pariutuminen ja säikeen pidennys. | DNA-replikaatiossa on kolme vaihetta; aloitus, venymä ja lopetus. |
| Primereiden osallistuminen | |
| PCR tarvitsee keinotekoisia alukkeita. | DNA:n replikaatio ei tarvitse keinotekoisia alukkeita. Lyhyt RNA-fragmentti osallistuu DNA:n replikaatioon. |
| Kaksoissäikeiden denaturointi | |
| Kaksisäikeet erotetaan käyttämällä korkeaa lämpötilaa PCR:ssä. | DNA-replikaatiossa DNA-helikaasientsyymi erottaa kaksoisjuosteet toisistaan. |
| Entsyymi mukana | |
| PCR käyttää Taq-polymeraasia. | DNA-replikaatio käyttää DNA-polymeraasia. |
| Lämpötila | |
| PCR tapahtuu kolmessa eri lämpötilassa koneen sisällä. | DNA:n replikaatio tapahtuu kehon lämpötilassa elävän organismin kehossa. |
| In vivo tai In vitro | |
| PCR on in vitro -menetelmä. | DNA-replikaatio on in vivo -menetelmä. |
Yhteenveto – PCR vs DNA:n replikaatio
DNA:n replikaatio on prosessi, jossa yhdestä DNA-molekyylistä tuotetaan kaksi identtistä DNA-kopiota. Sitä esiintyy kaikissa elävissä organismeissa, koska se tarjoaa menetelmän geneettisen tiedon välittämiseksi vanhemmilta jälkeläisille. Se koostuu kolmesta entsymaattisesti katalysoidusta vaiheesta, jotka ovat aloitus, pidennys ja lopetus. DNA-replikaatio voidaan tehdä keinotekoisesti laboratoriossa. PCR on yksi tapa tuottaa suuri määrä DNA-kopioita kiinnostuneesta DNA:sta. PCR suoritetaan rutiininomaisesti molekyylibiologisissa laboratorioissa, koska se on helppo menetelmä tuottaa kopioita DNA:sta. Tämä on ero PCR:n ja DNA:n replikaation välillä.
