PCR vs reaaliaikainen PCR
PCR tai polymeraasiketjureaktio on vallankumouksellinen löytö modernissa molekyylibiologiassa, jonka kemisti Kary Mullis kehitti ensimmäisenä vuonna 1983. Se mahdollistaa yksittäisen monimutkaisen DNA:n sekvenssin monistamisen analyysiä varten. PCR:n perusajatuksena on, että kaksi aluketta, jotka ovat komplementaarisia DNA-sekvenssin vastakkaisille juosteille, on suunnattu toisiaan kohti; alukkeet tuottavat komplementaarisia juosteita, joista kukin sisältää toisen alukkeen. Näin ollen tuloksena on suuri määrä sekvenssiä, joka vastaa kahden alukkeen välissä olevaa DNA:ta. DNA-polymeraasientsyymiä käytetään alukkeiden pidentämiseen PCR:ssä. DNA-polymeraasi on lämpöstabiili entsyymi, ja sillä on kyky selviytyä korkeissa lämpötiloissa (94-95 °C), jota käytetään templaatti-DNA:n denaturointiin.
PCR sisältää kolme vaihetta, nimittäin toistuvat denaturaatiokierrokset, alukkeiden pariuttaminen ja DNA:n synteesi. Tämän reaktion suorittamiseen käytetään lämpösyklikonetta, jotta se voidaan ohjelmoida muuttamaan lämpötiloja nopeasti ja tarkasti. PCR:n sovelluksia ovat rikostutkinta, DNA-sormenjälki, patogeenien havaitseminen ja varhaisten ihmislajien DNA-analyysi.
Mikä on perinteinen PCR?
Perinteisessä PCR:ssä on kolme päävaihetta, nimittäin; DNA:n monistusvaihe, PCR:n erottaminen ja tuotteiden havaitseminen. DNA-segmenttien erottaminen tehdään tyypillisesti agaroosigeelielektroforeesilla. Tuotteet värjätään sitten etheiduimibromidilla. Lopuksi havaitseminen saavutetaan visualisoimalla vyöhykkeitä geeleille UV-valossa. Siksi tavanomaisen PCR:n lopullisia tuloksia ei ilmaista numeroina. Normaalisti tavanomainen PCR pystyy havaitsemaan vain yhden parametrin.
Mikä on reaaliaikainen PCR?
Reaaliaikainen PCR voi havaita tuotteiden monistumisen, kun tuotteet syntetisoidaan. Teknologian kehityksen myötä PCR:stä on tullut erittäin suosittu tekniikka, erityisesti elintarvikkeissa olevien bakteerien havaitsemiseen ja tunnistamiseen. Reaaliaikainen PCR käyttää fluoresoivaa värijärjestelmää ja lämpösyklilaitetta, joka on varustettu fluoresenssien havaitsemistoiminnolla.
Mitä eroa on perinteisellä PCR:llä ja reaaliaikaisella PCR:llä?
• Perinteinen PCR on aikaavievämpi, koska se käyttää geelielektroforeesia monistettujen PCR-tuotteiden analysointiin. Sitä vastoin reaaliaikainen PCR on vähemmän aikaa vievä, koska se voi havaita vahvistukset reaktion alkuvaiheissa.
• Reaaliaikainen PCR kerää tietoja PCR:n eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa, kun taas perinteinen PCR kerää dataa reaktion loppupisteessä.
• Perinteisen PCR:n loppupistetulokset eivät ehkä ole kovin tarkkoja, mutta reaaliaikaisen PCR:n tulokset ovat erittäin tarkkoja.
• Reaaliaikainen PCR on herkempi kuin tavanomainen PCR.
• Perinteisellä PCR:llä on erittäin huono resoluutio, kun taas reaaliaikainen PCR voi havaita hyvin vähän muutoksia korkean resoluution vuoksi.
• Perinteisen PCR:n päätepisteiden havaitsemisella on lyhyt dynaaminen alue, kun taas reaaliaikaisella PCR-detektiolla on laaja dynaaminen alue.
• Toisin kuin perinteisessä PCR:ssä, reaaliaikaisessa PCR:ssä on automaattisia havaitsemistekniikoita.
• Perinteinen PCR on erittäin pitkälle kehitetty ja työvoimav altainen enemmän kuin reaaliaikainen PCR.
• Toisin kuin reaaliaikainen PCR, perinteinen PCR ei pysty erottamaan kuolleita ja eläviä bakteereja.
• Reaaliaikainen PCR käyttää fluoresoivaa väriainejärjestelmää tuotteiden havaitsemiseen, kun taas perinteinen PCR käyttää etidiumbromidia ja UV-valoa vyöhykkeiden visualisoimiseen agaroosigeeliväliaineessa.
