Avainero – RT PCR vs QPCR
Polymeraasiketjureaktio on tekniikka, jota käytetään DNA:n tietyn alueen monistamiseen in vitro. Kary Mullisin vuonna 1983 keksimän tämän tekniikan ansiosta tutkijat pystyvät tekemään tuhansia tai miljoonia kopioita tietyistä DNA-fragmenteista tutkimustarkoituksiin. Tällä hetkellä siitä on tullut yleinen ja rutiininomaisesti käytetty tekniikka kliinisissä ja tutkimuslaboratorioissa monenlaisiin sovelluksiin. Perinteisestä PCR-tekniikasta on olemassa muunnelmia, kuten RT PCR, sisäkkäinen PCR, multipleksinen PCR, Q PCR, RT – QPCR jne. RT PCR ja Q PCR ovat kaksi tärkeää PCR:n muunnelmaa. Keskeinen ero RT PCR:n ja Q PCR:n välillä on se, että RT PCR:ää käytetään geenin ilmentymisen havaitsemiseen luomalla komplementaarisia DNA- (cDNA) transkriptejä RNA:sta, kun taas Q PCR:ää käytetään PCR-tuotteiden kvantitatiiviseen mittaamiseen reaaliajassa fluoresoivilla väriaineilla.
Mikä on RT PCR?
Käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT PCR) on PCR:n muunnos, jota käytetään RNA:n ilmentymisen havaitsemiseen. Se on erittäin tärkeä menetelmä mRNA:n ilmentymisen havaitsemiseksi kudoksissa. RT PCR:ää käytetään, kun näytteen lähtöaine on RNA. RT PCR:ssä templaatti-mRNA muunnetaan ensin komplementaariseksi DNA:ksi. Tätä vaihetta katalysoi käänteistranskriptaasientsyymi, ja prosessi tunnetaan käänteiskopioijana. Toiseksi, perinteistä PCR:ää käytetään äskettäin syntetisoidulle cDNA:lle monistukseen.
RT PCR on erittäin herkkä tekniikka, joka vaatii suhteellisen pienen määrän RNA-näytettä. RT PCR:ää käytetään yleisesti RNA-lajien, erityisesti RNA-virusten, kuten ihmisen immuunikatoviruksen ja hepatiitti C -viruksen, diagnosoinnissa ja kvantifiointissa.
Kuva 01: RT PCR -tekniikka
Mikä on QPCR?
Kvantitatiivinen PCR (QPCR) on PCR-muunnos, jota käytetään PCR-tuotteiden kvantitatiiviseen mittaamiseen. Sitä kutsutaan myös reaaliaikaiseksi polymeraasiketjureaktioksi, koska se mittaa reaaliaikaisen vahvistuksen käyttämällä reaaliaikaista PCR-laitetta. Se on sopiva menetelmä näytteessä olevan kohdesekvenssin tai geenin määrän määrittämiseen. QPCR:n mielenkiintoinen ominaisuus on, että se yhdistää sekä amplifioinnin että todellisen kvantifioinnin yhdeksi vaiheeksi. Siksi geelielektroforeesin tarve detektiossa voidaan eliminoida QPCR-tekniikalla. QPCR käyttää fluoresoivia väriaineita PCR-tuotteiden leimaamiseen PCR-reaktioiden aikana, jotka lopulta johtavat suoraan kvantifiointiin. Kun PCR-tuotteet kerääntyvät, myös fluoresoivat signaalit kerääntyvät ja ne mitataan reaaliaikakoneella. QPCR voidaan yhdistää RT PCR:ään. Se tunnetaan nimellä RT - QPCR tai QRT - PCR, ja sitä pidetään tehokkaimpana, herkimpänä ja kvantitatiivisena menetelmänä RNA-tasojen havaitsemiseksi soluissa tai kudoksissa.
SYBR Green ja Taqman ovat kaksi menetelmää, joita käytetään havaitsemaan tai seuraamaan reaaliaikaisen PCR:n vahvistusprosessia. SYBR Green -menetelmä suoritetaan käyttämällä fluoresoivaa väriainetta nimeltä SYBR green, ja se havaitsee monistumisen sitomalla väriaineen tuottamaan kaksijuosteista DNA:ta. Taqman suoritetaan käyttämällä kaksoisleimattuja koettimia ja se havaitsee monistumisen Taq-polymeraasin aiheuttaman koettimen hajoamisen ja fluoroforin vapautumisen, kuten kuvassa 02 on esitetty. Molemmat menetelmät seuraavat monistusprosessin etenemistä ja raportoivat tuotteen määrän reaaliajassa.
Reaaliaikaisella PCR:llä on monenlaisia sovelluksia, kuten geeniekspression kvantifiointi, mikro-RNA:n ja ei-koodaavan RNA:n analyysi, SNP-genotyypitys, kopiolukuvarianttien havaitseminen, harvinaisten mutaatioiden havaitseminen, geneettisesti muunnettujen organismien havaitseminen, tartuntatekijöiden havaitseminen jne.
Kuva 02: Kvantitatiivinen PCR-tekniikka
Mitä eroa on RT PCR:n ja QPCR:n välillä?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR on tekniikka, jota käytetään geenin ilmentymisen havaitsemiseen amplifikaatiolla. | QPCR on tekniikka, joka monistaa DNA:ta ja kvantifioi PCR-tuotteet reaaliajassa. |
| Käänteiskopioijaentsyymin osallisuus | |
| Entsyymin käänteistranskriptaasia käytetään RT PCR:ssä. | Entsyymin käänteiskopioijaentsyymiä ei käytetä QPCR:ssä. |
| Fluoresoivasti merkittyjen molekyylien käyttö | |
| Fluoresoivasti leimattuja väriaineita tai koettimia ei käytetä RT PCR:ssä. | QPCR:ssä käytetään fluoresoivasti merkittyjä väriaineita tai koettimia. |
| PCR-tuotteen kvantifiointi | |
| Ellei sitä ole yhdistetty QPCR:ään, RT PCR ei määritä PCR-tuotetta kvantitatiivisesti. | QPCR mittaa PCR-tuote kvantitatiivisesti. |
| Aloitusmateriaali | |
| Lähtömateriaali on mRNA. | Lähtömateriaali on DNA. |
| cDNA:n synteesi | |
| RT PCR:n aikana tuotetaan komplementaarista DNA:ta. | Komplementaarista DNA:ta ei tuoteta QPCR:n aikana. |
Yhteenveto – RT PCR vs QPCR
RT PCR ja QPCR ovat kaksi versiota perinteisestä PCR:stä. RT PCR -tekniikka suoritetaan mRNA-näytteille ja sitä ohjaa käänteistranskriptio ja cDNA:n tuotanto. QPCR:ää käytetään PCR-tuotteiden kvantifiointiin reaaliaikaisten PCR-lämpösyklien aikana käyttämällä fluoresoivia väriaineita tai leimattuja koettimia. QPCR:ssä PCR-tuotteen määrää edustavat näytteen lähettämät fluoresoivat signaalit. RT PCR:ää käytetään yleisesti monistusprosessina, kun taas QPCR:ää käytetään yleisesti kvantifiointiprosessina. Tämä on ero RT PCR:n ja QPCR:n välillä.
