Avainero – RAPD vs RFLP
Geneettisiä markkereita käytetään molekyylibiologiassa yksilöiden ja lajien välisten geneettisten variaatioiden tunnistamiseen. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ja Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ovat kaksi tärkeää molekyylimarkkeria, joita käytetään rutiininomaisesti laboratorioissa. RAPD suoritetaan lyhyillä ja mieliv altaisilla oligonukleotidialukkeilla, ja se perustuu organismin templaatti-DNA:n useiden paikkojen satunnaiseen monistumiseen. RFLP suoritetaan spesifisellä restriktioendonukleaasilla ja se perustuu tuloksena olevien restriktiofragmenttien polymorfismiin ja hybridisaatioon. Keskeinen ero RAPL:n ja RFLP:n välillä on se, että RAPD on eräänlainen PCR-tekniikka, joka suoritetaan ilman aikaisempaa sekvenssitietoa, kun taas RFLP ei ole osallisena PCR:ssä ja vaatii aiempaa sekvenssitietoa tekniikan suorittamiseksi.
Mikä on RAPD?
RAPD on hyödyllinen molekyylimarkkeri molekyylibiologiassa. Se on nopea ja helppo tekniikka. RAPD voidaan määritellä menetelmäksi, joka johtaa polymorfisiin DNA-sekvensseihin kohde-DNA-templaatin useiden paikkojen satunnaisen monistumisen seurauksena. RAPD käyttää lyhyitä oligonukleotidialukkeita mieliv altaisilla sekvensseillä PCR-monistukseen. Alukkeet syntetisoidaan keinotekoisesti ilman aiempaa sekvenssitietoa. Siksi sitä pidetään helppona ja hyödyllisenä tekniikkana.
Seuraavat tärkeät vaiheet liittyvät RAPD:hen.
- Kohde-DNA:n uuttaminen
- Kohde-DNA:n useiden sijaintien monistus satunnaisesti valituilla alukkeilla
- Amplifioitujen PCR-tuotteiden geelielektroforeesi
- Värjäys etidiumbromidilla ja polymorfismin tunnistaminen
Alukkeen pariutumisen vaihtelun seurauksena monistuksen aikana syntyy erilaisia fragmentteja, joilla on eri pituus. Tästä syystä geelien nauhakuviot ovat erilaisia yksilöiden ja lajien välillä. Siten RAPD mahdollistaa geneettisen variaation havaitsemisen organismien välillä tunnistamisessa ja erilaistumisessa.
RAPD:tä käytetään erilaisissa molekyylibiologian tutkimuksissa, kuten läheisten lajien välisten geneettisten erojen tunnistamisessa, geenikartoituksissa, DNA-sormenjälkien ottamisessa, perinnöllisten sairauksien tunnistamisessa jne.
Kuva 01: RAPD
Mikä on RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP:t) on molekyylimarkkeri, jota käytetään molekyylibiologiassa homologisten DNA-sekvenssien geneettisen variaation tunnistamiseen. Se on ensimmäinen geneettinen merkki, joka on kehitetty DNA-sormenjälkien ottamiseen. Kaikki organismit tuottavat ainutlaatuisia DNA-profiileja, kun niitä rajoitetaan tietyillä restriktioentsyymeillä. RFLP toimii tärkeänä työkaluna yksilöiden ainutlaatuisten DNA-profiilien tuottamisessa ja geneettisen muunnelman havaitsemisessa. Kun DNA-näytteitä pilkotaan spesifisillä restriktioendonukleaaseilla, saadaan erilaisia DNA-profiileja, jotka ovat ainutlaatuisia jokaiselle yksilölle. Siksi tämän menetelmän periaate on geneettisen variaation havaitseminen organismien välillä restriktioimalla homologinen DNA spesifisillä restriktioentsyymeillä ja fragmentin pituuden polymorfismin analysointi geelielektroforeesilla ja blottauksella. Blottauskuviot ovat yksilöllisiä jokaiselle organismille ja luonnehtivat tietyille genotyypeille.
Seuraavat vaiheet liittyvät RFLP:hen.
- Riittävä määrä DNA:ta eristetään näytteistä
- DNA-näytteiden fragmentointi spesifisillä restriktioendonukleaaseilla lyhyeksi sekvenssiksi
- Saadun eripituisten fragmenttien erottaminen agaroosigeelielektroforeesilla.
- Geeliprofiilin siirto kalvoon Southern-blottauksella
- Membraanin hybridisaatio leimatuilla koettimilla ja fragmentin pituuden polymorfismin analysointi kussakin profiilissa
RFLP:llä on useita sovelluksia, kuten perinnöllisten sairauksien diagnosointi, genomikartoitus, rikosoikeudellinen tunnistaminen oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa, isyystestaus jne.
Kuva 02: RFLP-genotyypitys
Mitä eroa on RAPD:llä ja RFLP:llä?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD on molekyylimarkkeri, joka perustuu satunnaisiin alukkeisiin ja PCR:ään. | RFLP on molekyylimarkkeri, joka perustuu eripituisten restriktiofragmenttien tuotantoon. |
| Pakollinen näyte | |
| Pienet DNA-näytteet riittävät RAPD-analyysiin. | RFLP-analyysiin tarvitaan suuri määrä uutettua DNA-näytettä. |
| Aika | |
| RAPD on nopea prosessi. | RFLP on aikaa vievä prosessi. |
| Primer Use | |
| Satunnaisia alukkeita käytetään ja samoja alukkeita voidaan käyttää eri lajeille. | Lajikohtaisia koettimia käytetään RFLP:ssä hybridisaatioon. |
| Luotettavuus | |
| Tekniikan luotettavuus on heikompi verrattuna RFLP:hen. | RFLP on luotettava tekniikka. |
| Blotting | |
| RAPD sisältää Southern blottingin. | Southern blotting on yksi vaihe RFLP:ssä. |
| Alleelisen variaation havaitseminen | |
| RAPD ei pysty havaitsemaan alleelisia muunnelmia. | RFLP voi havaita alleeliset vaihtelut. |
| Sekvenssitiedon tarve | |
| RAPD ei vaadi aiempaa sekvenssitietoa. | Luotaimen suunnittelussa vaaditaan aikaisempaa sekvenssitietoa. |
| PCR | |
| PCR liittyy RAPD:hen | PCR ei liity RFLP:hen. |
| Toistettavuus | |
| RAPD:llä on heikko toistettavuus | RFLP:llä on korkea toistettavuus verrattuna RAPD:hen. |
Yhteenveto – RAPD vs RFLP
RAPD ja RFLP ovat tärkeitä markkereita, joita käytetään molekyylibiologiassa. Molemmat menetelmät pystyvät havaitsemaan geneettisen vaihtelun organismien välillä. RAPD suoritetaan käyttämällä satunnaisia alukkeita. RFLP suoritetaan käyttämällä spesifisiä restriktioentsyymejä. Molemmat menetelmät tuottavat yksittäisille organismeille ainutlaatuisia DNA-profiileja. RAPD sisältää verrattain vähän vaiheita kuin RFLP. Mutta se tuottaa vähemmän luotettavia ja toistettavia tuloksia kuin RFLP. Tämä on tärkein ero RAPD:n ja RFLP:n välillä.
