Avainero – PCR-alukkeet vs. sekvensointialukkeet
Molekyylibiologian alan viimeaikaisen kehityksen myötä kehitettiin erilaisia geneettisiä tekniikoita, jotka tekivät aiheen eri alueiden tutkimusprosessista helppoa ja tarkkaa. PCR ja muut sekvensointimenetelmät ovat kaksi tärkeää tällaista tekniikkaa. He käyttävät erilaisia alikomponentteja. Alukkeita pidetään sekä PCR- että sekvensointitekniikoiden yhteisenä pääkomponenttina. PCR-alukkeita käytetään tietyn DNA-sekvenssin monistamiseen, kun taas sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen spesifinen nukleotidisekvenssin järjestys. Tämä on avainero PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä.
Mitä PCR-alukkeet ovat?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on geneettinen tekniikka, jota käytetään molekyylibiologian alalla yksittäisen tai muutaman kopion vahvistamiseksi tietystä DNA-segmentistä ja useiden miljoonien identtisten kopioiden saamiseksi. PCR-reaktiossa käytetään erilaisia komponentteja, mukaan lukien alukkeet. Alukkeet ovat lyhyitä DNA-säikeitä, joiden nukleotidipituus on 18-25, mikä tekee niistä yhteensopivia monistettavien DNA-fragmenttien alku- ja loppualueen kanssa. Pohjusteet voivat olla eteenpäin- ja käänteisalukkeita. Nämä alukkeet sitoutuvat DNA-fragmenttiin tietyissä kohdissa, joissa se saa DNA-polymeraasin sitoutumaan spesifiseen alukkeeseen ja käynnistämään uuden DNA-juosteen synteesin.
Alukkeiden valinta on tärkeä osa PCR-prosessia. Pohjamaalin pituuden valinta on tärkeää. Ihanteellinen pituus olisi 18-25 nukleotidia. Jos pituus on liian lyhyt tai liian pitkä, alukkeet eivät sitoudu monistettavaan DNA-sekvenssiin tarkasti. Liian lyhyet alukkeet johtavat epäspesifiseen alukkeen pariutumiseen DNA-sekvenssin eri kohdissa.
Kuva 01: PCR-alukkeet
Guaniini- ja sytosiinipitoisuuden (GC) tulisi hyvässä pohjamaalissa olla välillä 40-60. Alukkeen pariutumislämpötila ja sulamislämpötila ovat tärkeitä tekijöitä PCR:n aikana. Sulamislämpötila tulee laskea tarkasti, ja pohjamaalin hehkutuslämpötilan tulee olla 5 0C alempi kuin sulamislämpötila. Sulamislämpötilan tulee olla 60 °C ja 75 °C. Liian korkea tai liian matala lämpötila johtaa vähemmän aktiiviseen DNA-polymeraasiaktiivisuuteen.
Mitä ovat sekvensointialukkeet?
Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen spesifinen identiteetti. Hyvien sekvensointitulosten saavuttamiseksi korkealaatuiset alukkeet ja mallit ovat tärkeitä. Siten, kun alukkeita valitaan, niiden tulisi olla ainutlaatuisia tietylle alueelle, jolla haluamme sekvensoida. Sen tulisi myös olla oikeassa suunnassa, jossa sekvenssit yleensä muodostetaan alukkeiden 3'-5' päistä. Sarjasta ei tulisi puuttua ei-toivottua itsehybridisaatiota, kuten hiusneulasilmukoiden muodostumista. Se ei saa sisältää peräkkäistä guaniiniemästen muodostumista.
Primerin sulamislämpötilan (Tm) tulee olla sekvensoinnin olosuhteisiin sopiva. Siksi sen pitäisi olla välillä 52oC ja 74oC. Alukkeena käytettävien oligonukleotidien valmistaminen tulisi puhdistaa halutun täyspituuden saamiseksi sekvenssistä. Jos oligonukleotidit sisältävät epäpuhtauksia, alukesekvenssin signalointi päällekkäin eri alukekohdista, ja se myös vähentää perussolujen määrää.
Kuva 02: Alukkeiden sekvensointi
Oligonukleotidin alukkeen sulamislämpötila (Tm) määrittää, kuinka vahvasti komplementaariset DNA-juosteet hybridisoituvat keskenään. Tm:tä voidaan pitää termodynaamisena laskelmana, jossa se on riippuvainen sekä DNA-sekvensseistä että useista olosuhteista, kuten suolapitoisuudesta. Tm on tärkeä PCR:n aikana, jossa syklisekvensointiksi kutsuttua varianttia käytetään tuottamaan ryhmä dideoksinukleotidipäätettyjä fragmentteja. Tässä sekvensoitu aluke paritetaan aluksi vaihtoehtoisesti, sitten pidennetään ja lopuksi denaturoidaan monistusta varten. Siksi Tm-arvon tulisi olla välillä 52oC ja 74o C. Syntetisoidut oligonukleotidit voidaan saada DNA/RNA-synteesilaboratorioista kohdan mukaisesti. valinta. DNA-sekvensointiin käytetty synteesi pieni mittakaava on yleensä 50 nmol. Ja mikä tärkeintä, sekvensointiin käytetyt alukkeet tulee puhdistaa niin, että ne eivät sisällä epäpuhtauksia, jotka estävät laadun heikkenemisen.
Mitä yhtäläisyyksiä PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä on?
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet ovat alukkeita, joita käytetään kohdistetun DNA-sekvenssin monistusprosessissa.
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet koostuvat nukleotideista.
- Sekä PCR-alukkeet että sekvensointialukkeet ovat lyhyitä oligomeerejä.
Mitä eroa on PCR-alukkeilla ja sekvensointialukkeilla?
PCR-alukkeet vs sekvensointialukkeet |
|
| PCR-alukkeet ovat lyhyitä DNA-säikeitä, joiden nukleotidisekvenssin pituus on 18-25, mikä tekee niistä yhteensopivia monistettavien DNA-fragmenttien alku- ja loppualueen kanssa. | Sekvensointialukkeet ovat lyhyitä oligomeerejä, joita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnissa tarkoituksena paljastaa sen spesifinen identiteetti. |
| Toiminto | |
| PCR-alukkeita käytetään tietyn DNA-sekvenssin monistamiseen. | Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen erityinen identiteetti. |
| Tarvittavien alukkeiden lukumäärä | |
| Kaksi aluketta; yhtä eteenpäin-aluketta ja yhtä käänteistä aluketta käytetään PCR-alukkeina. | Tarvitset vain yhden alukkeen sekvensointialukkeeksi. |
Yhteenveto – PCR-alukkeet vs sekvensointialukkeet
Sekvensointialukkeita käytetään DNA-fragmentin sekvensoinnin yhteydessä tarkoituksena paljastaa sen spesifinen identiteetti. Yksi sekvensointialuke riittää prosessin suorittamiseen. Hyvien sekvensointitulosten saavuttamiseksi korkealaatuiset alukkeet ja mallit ovat tärkeitä. Siten, kun alukkeita valitaan, niiden tulisi olla ainutlaatuisia tietylle alueelle, jolla haluamme sekvensoida. PCR-alukkeet ovat lyhyitä DNA-säikeitä, joiden nukleotidipituus on 18-25 ja joka on yhteensopiva monistettavien DNA-fragmenttien aloitus- ja loppualueen kanssa. PCR-alukkeet voivat olla eteenpäin suunnattuja alukkeita ja käänteisiä alukkeita. Hyvän pohjamaalin guaniini- ja sytosiinipitoisuuden (GC) tulisi olla välillä 40-60. Alukkeen pariutumislämpötila ja sulamislämpötila ovat tärkeitä näkökohtia PCR:n aikana. Tämä on ero PCR-alukkeiden ja sekvensointialukkeiden välillä.
