Avainero – AFLP vs RFLP
DNA-tutkimuksilla on v altava merkitys fylogeneettisten suhteiden ymmärtämisessä ja määrittämisessä, geneettisten sairauksien diagnosoinnissa ja organismien genomien kartoittamisessa. Useita DNA-analyysiin liittyviä tekniikoita käytetään myös tietyn geenin tai DNA-sekvenssin tunnistamiseen tuntemattoman DNA:n poolista. Ne tunnetaan molekyylimarkkereina. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ja Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ovat kaksi tällaista molekyylimarkkeria (menetelmää), jotka on kehitetty molekyylibiologiassa havaitsemaan geneettistä vaihtelua organismien välillä. Molemmat menetelmät ovat yhtä tärkeitä ja niillä on etuja ja haittoja.avainero AFLP:n ja RFLP:n välillä on se, että AFLP sisältää pilkotun DNA:n selektiivisen PCR-monistuksen, kun taas RFLP ei sisällä DNA-fragmenttien selektiivistä PCR-monistusta.
Mikä on AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) on tärkeä työkalu molekyylibiologiassa ja sitä käytetään laajasti geneettisen variaation analysoinnissa. AFLP perustuu fragmentoituneen genomisen DNA:n spesifiseen PCR-monistukseen ja polymorfismin havaitsemiseen autoradiografialla geelielektroforeesin avulla. AFLP auttaa laajasti tunnistamaan geneettisiä eroja eri v altakuntien kannoissa tai läheisesti sukulaislajeissa, mukaan lukien kasvit, eläimet, bakteerit ja sienet. AFLP voidaan suorittaa pienillä määrillä tuntemattomia DNA-näytteitä. Se ei vaadi aiempaa sekvenssituntemusta ja koettimien suunnittelua.
AFLP:n vaiheet
- DNA:n eristäminen
- DNA:n pilkkominen restriktioendonukleaaseilla
- Rajoitettujen DNA-fragmenttien ligaatio sovittimilla
- Fragmenttien valikoiva monistus spesifisillä restriktiokohdilla
- PCR-tuotteiden erottaminen geelielektroforeesilla
- Geelimatriisin visualisointi autoradiografialla
AFLP on herkempi ja toistettavampi menetelmä, jota voidaan käyttää useiden taksonien, kuten sienten, bakteerien, kasvien ja eläinten DNA-profilointiin ilman DNA-sekvensseistä aiempaa tietoa. Se auttaa tunnistamaan pienet erot yksilöiden välillä populaatioissa sen erittäin herkän luonteen vuoksi. AFLP on tärkeä myös genomikartoituksessa, oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa, vanhempien testaamisessa, genotyypin määrittämisessä jne.
Kuva 01: AFLP
Mikä on RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP:t) on tekniikka, jota käytetään homologisten DNA-sekvenssien geneettisten variaatioiden havaitsemiseen. Se on ensimmäinen DNA-profilointiin kehitetty menetelmä. Organismeilla on ainutlaatuiset DNA-sormenjäljet tai DNA-profiilit. RFLP toimii tärkeänä työkaluna spesifisten tai läheisesti sukua olevien organismien DNA-profiilien välisen vaihtelun analysoinnissa, koska homologisilla sekvensseillä on erilaiset restriktiokohdat (paikat), jotka ovat ainutlaatuisia tietylle organismille. Kun homologista DNA:ta pilkotaan spesifisillä restriktioendonukleaaseilla, tuloksena on erilaisia DNA-profiileja, jotka ovat ainutlaatuisia jokaiselle yksilölle. Siksi tämän menetelmän periaate on geneettisen variaation havaitseminen organismien välillä restriktioimalla homologinen DNA spesifisillä restriktioentsyymeillä ja fragmentin pituuden polymorfismin analysointi geelielektroforeesilla ja blottauksella. Blottauskuviot ovat yksilöllisiä jokaiselle organismille ja luonnehtivat tietyille genotyypeille.
RFLP:n vaiheet
- Riittävä määrä DNA:ta eristetään näytteistä
- DNA-näytteiden fragmentointi spesifisillä restriktioendonukleaaseilla lyhyeksi sekvenssiksi
- Saadun eripituisten fragmenttien erottaminen agaroosigeelielektroforeesilla.
- Geeliprofiilin siirto kalvoon Southern-blottauksella
- Membraanin hybridisaatio leimatuilla koettimilla ja fragmentin pituuden polymorfismin analysointi kussakin profiilissa
RFLP on erittäin tärkeä tekniikka taudin periytymisen havaitsemisessa ja taudin esiintymisen riskin selvittämisessä perheenjäsenten keskuudessa. RFLP:tä käytetään usein myös genomikartoituksessa, rikollisten tunnistamisessa oikeuslääketieteessä, isyystestauksessa jne. RFLP:llä on myös useita rajoituksia. RFLP vaatii ennakkotietoa sekvenssitiedoista koettimien suunnittelemiseksi hybridisaatiota varten. Se edellyttää myös riittävän DNA-määrän eristämistä analysoitavasta näytteestä, mikä on vaikeaa oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa.
Kuva 01: RRFLP-kartoitus
Mitä eroa on AFLP:llä ja RFLP:llä?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP sisältää pilkotun DNA:n selektiivisen PCR-monistuksen. | RFLP ei sisällä PCR:ää, ellei se ole PCR-RFLP. |
| Sequence Knowledge | |
| Aiempaa järjestystietoa ei vaadita. | Suunniteltujen RFLP-koettimien edellytetään aiempaa sekvenssituntemusta. |
| Luotettavuus | |
| Tämä on luotettavampi. | Tämä on vähemmän luotettava kuin AFLP. |
| Tehokkuus polymorfismin havaitsemisessa | |
| Tällä on suurempi tehokkuus polymorfismin havaitsemisessa kuin RFLP:llä. | Tämä on vähemmän tehokas kuin AFLP. |
| Kustannus | |
| Tämä on vähän kallis verrattuna RFLP:hen. | Tämä on halvempaa kuin AFLP. |
| Applications | |
| AFLP:itä on sovellettu genomikartoituksessa, DNA-sormenjälkien ottamisessa, geneettisen monimuotoisuuden tutkimuksissa, isyystestauksessa ja oikeuslääketieteen tutkimuksissa | RFLP-analyysi on tärkeä työkalu genomikartoituksessa, geneettisten häiriöiden geenien lokalisoinnissa, sairausriskin määrittämisessä ja isyystestauksessa. |
Yhteenveto – AFLP vs RFLP
AFLP ja RFLP ovat kaksi tekniikkaa, joita käytetään geneettisinä markkereina monimuotoisuuden ja geneettisten suhteiden arvioimiseen molekyylibiologiassa. AFLP toimii tehokkaana ja herkkänä menetelmänä geneettisen polymorfismin havaitsemiseksi organismien välillä kuin RFLP. Vaikka näillä molemmilla menetelmillä on erilainen tehokkuus geneettisten muunnelmien havaitsemisessa, niitä käytetään silti DNA-sormenjälkien ottamiseen ja sairauksien diagnosointiin.
