Avainero – nitroselluloosa vs PVDF
Western blottaus on menetelmä, joka mahdollistaa tiettyjen proteiinien havaitsemisen ja kvantifioinnin proteiininäytteestä. Tekniikan luotettavuus riippuu oikean kalvon valinnasta proteiinien imeytymistä varten geelistä. Mikrohuokoisia kalvoja on erilaisia. Nitroselluloosa- ja PVDF-kalvot ovat kaksi tällaista kalvoa, joita tutkijat suosivat niiden erityisominaisuuksien vuoksi muihin kalvotyyppeihin verrattuna. Valinta nitroselluloosan tai PVDF:n välillä on myös toinen haaste Western blottauksessa. Sekä nitroselluloosalla että PVDF:llä on korkea proteiinin absorptiokyky. Keskeinen ero nitroselluloosan ja PVDF-kalvon välillä on se, että nitroselluloosakalvoilla ei ole kykyä poistaa vasta-aineita ja käyttää kalvoa uudelleen vasta-aineiden tutkimiseen, kun taas PVDF-kalvoilla on irrotus- ja uudelleenkäyttökyky.
Mikä on nitroselluloosa?
Nitroselluloosa on polymeeri, joka valmistetaan käsittelemällä selluloosaa typpihapolla ja jota käytetään mikrohuokoisten kalvojen valmistukseen molekyylibiologiassa, erityisesti blotting-tekniikoissa, kuten Southern-, Northern- ja Western-blottauksessa. Nitroselluloosakalvojen huokoskoot ovat 3-20 µm. Mikrohuokoiset nitroselluloosakalvot helpottavat kalvon pinnalla tapahtuvien immunokemiallisten reaktioiden havaitsemista. Siksi nitroselluloosakalvoja käytetään usein proteiinien immobilisointiin ja spesifisten proteiinien havaitsemiseen Western blot -menetelmässä. Nitroselluloosakalvot voivat myös immobilisoida glykoproteiineja ja nukleiinihappoja.
Nitroselluloosakalvot ovat suositeltavia sivuvirtausmäärityksissä useiden ominaisuuksien vuoksi. Nitroselluloosakalvot imevät proteiineja korkeina pitoisuuksina. Kalvon kostuttamiseen käytetty liuotin ei vähennä nitroselluloosakalvoproteiinin imeytymistä. Nitroselluloosakalvot voidaan helposti leikata haluttuun geelikokoon ja siirtää proteiineja geelistä kalvolle sähkö- tai kapillaarisiirrolla. Nitroselluloosa mahdollistaa proteiinien nopeamman virtauksen kalvon läpi korkealla sitoutumispotentiaalilla. Nitroselluloosalla on parannettu käsittelylujuus. Toinen nitroselluloosakalvon erityinen ominaisuus on, että se voidaan helposti liimata liuottimattomilla, vettä hylkivillä liimoilla erilaisille muovitaustalle.
Kuva 01: Nitroselluloosakalvo Western blottaukseen
Mikä on PVDF?
Polyvinylideenidifluoridi (PVDF) on fluoripolymeeri, joka on tuotettu polymeroimalla vinylideenidifluoridia ja jolla on korkea proteiinien immobilisointikyky. Siksi PVDF:stä valmistettuja mikrohuokoisia kalvoja käytetään Western blot -tekniikoissa spesifisten proteiinien analysoimiseksi proteiiniseoksista. PVDF-kalvoja voidaan käyttää myös aminohappoanalyysiin ja proteiinien sekvensointiin. PVDF-kalvon tärkein ominaisuus nitroselluloosakalvon yläpuolella on, että se voidaan helposti poistaa vasta-aineista ja käyttää uudelleen myöhempiä vasta-ainekoettimia varten.
PVDF-kalvot ovat paksumpia kuin nitroselluloosakalvot; siten kestävämpi uudelleenkäytön aikana tapahtuville vaurioille. PVDF-kalvot ovat erittäin hydrofobisia. Siksi ne on liotettava metanolissa tai isopropanolissa ennen käyttöä.
Mitä eroa on nitroselluloosalla ja PVDF:llä?
Nitroselluloosa vs PVDF |
|
| Nitroselluloosa on selluloosasta koostuva polymeeri. | PVDF on fluoripolymeeri, joka on valmistettu polymeroimalla vinylideenidifluoridia. |
| Kalvan huokoskoko | |
| Tyypilliset huokoskoot ovat 0,1, 0,2 tai 0,45 μ | Tyypilliset huokoskoot ovat 0,1, 0,2 tai 0,45 μm |
| Proteiinia sitova kapasiteetti | |
| Nitroselluloosan proteiineja sitova kapasiteetti on 80-100 μg/cm2. | PVDF:n proteiineja sitova kapasiteetti on 170-200 μg/cm2. |
| Herkkyys | |
| Tällä on alhainen herkkyys verrattuna PVDF:ään. | Tällä on korkea herkkyys. |
| Vähän ilmentyneiden proteiinien havaitseminen | |
| Koska nitroselluloosakalvojen herkkyys on alhainen, se ei sovellu heikosti ilmentyneiden proteiinien havaitsemiseen. | Tämä sopii paremmin heikosti ilmentyneiden proteiinien havaitsemiseen korkean herkkyytensä vuoksi. |
| Taustakohina | |
| Tässä on matalampi taustamelu | Tässä on korkeampi taustakohina. |
| Vuorovaikutukset proteiinien kanssa | |
| Proteiinimolekyylit sitoutuvat nitroselluloosakalvoihin hydrofobisten vuorovaikutusten kautta. | Proteiinit sitoutuvat PVDF-kalvoihin hydrofobisten ja dipolivuorovaikutusten kautta. |
| Membraanin luonne | |
| Nitroselluloosa on hauras ja hauras. Nitroselluloosasta on kuitenkin saatavilla versioita, ja ne ovat kestäviä. | PVDF on kestävämpi ja sillä on korkeampi kemiallinen kestävyys. |
| Mahdollisuus poistaa ja käyttää uudelleen | |
| Nitroselluloosalla voi olla vaikeuksia irrottaa ja toistaa signaalia menettämättä. | PVDF on ihanteellinen uudelleenkoettamiseen ja sekvensointisovelluksiin. |
| Soveltuvuus | |
| Nitroselluloosa on ihanteellinen pienimolekyylipainoisten proteiinien havaitsemiseen. | PVDF soveltuu paremmin korkeamman molekyylipainon proteiinien havaitsemiseen. |
| Muut käyttötarkoitukset | |
| Nitroselluloosaa voidaan käyttää nukleiinihappoanalyysiin ja dot/slot blot -analyysiin. | PVDF:ää voidaan käyttää proteiinien sekvensointiin ja kiinteän faasin määritysjärjestelmiin. |
| Kustannus | |
| Tämä on halvempaa kuin PVDF-kalvot. | Tämä on kalliimpaa kuin nitroselluloosakalvot. |
| Esikostutuksen tarve | |
| Nitroselluloosakalvot eivät vaadi esiliotusta metanolilla | PVDF-kalvot vaativat esiliotuksen metanolilla. |
Yhteenveto – Nitroselluloosa vs PVDF
Nitroselluloosakalvot olivat ensimmäiset kalvot, joita käytettiin kaupallisesti lateraalivirtausmäärityksissä. Niillä on korkea kyky imeä proteiineja. Siksi Western blot -menetelmässä käytetään nitroselluloosakalvoja. PVDF on toinen Western blottauksessa käytetty kalvo, ja sillä on myös korkea proteiinin absorptiokyky. Molempia tyyppejä käytetään Western blot -menetelmässä proteiinianalyysissä. PVDF-kalvoilla on kuitenkin erityisominaisuuksia, mikä tekee niistä sopivampia kuin nitroselluloosakalvot Western blottaukseen. Mutta nitroselluloosakalvot sopivat paremmin pienimolekyylipainoisten proteiinien havaitsemiseen, PVDF-kalvot sopivat paremmin suurimolekyylipainoisten proteiinien havaitsemiseen. Tämä on ero nitroselluloosa- ja PVDF-kalvojen välillä.
