Avainero – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green ja Taqman ovat kaksi menetelmää, joita käytetään havaitsemaan tai seuraamaan reaaliaikaisen PCR:n vahvistusprosessia. SYBR Green on menetelmä, joka perustuu interkaloituvaan nukleiinihappovärjäysväriin, kun taas Taqman on hydrolyysikoettimeen perustuva menetelmä. Molemmat tekniikat on suunniteltu tuottamaan fluoresenssia PCR:n aikana, mikä mahdollistaa reaaliaikaisen PCR-koneen tarkkailla reaktiota "reaaliajassa". SYBR Green -menetelmä suoritetaan käyttämällä fluoresoivaa väriainetta nimeltä SYBR green ja se havaitsee monistumisen sitomalla väriaineen tuotettuun kaksijuosteiseen DNA:han. Taqman suoritetaan käyttämällä kaksoisleimattuja koettimia, ja se havaitsee monistumisen hajottamalla koettimen Taq-polymeraasin vaikutuksesta ja fluoroforin vapautumisen. Tämä on tärkein ero SYBR Greenin ja Taqmanin välillä.
Mikä on SYBR Green?
SYBR Green on fluoresoiva väriaine, jota käytetään nukleiinihappojen, erityisesti kaksijuosteisen DNA:n värjäämiseen molekyylibiologiassa. SYBR Green -menetelmää käytetään PCR-tuotteiden kvantifiointiin reaaliaikaisen PCR:n aikana. Kun se sitoutuu DNA:han, tuloksena oleva DNA-värikompleksi imee sinistä valoa ja lähettää voimakasta vihreää valoa. Se johtuu rakenteellisesta muutoksesta, joka tapahtuu värimolekyylissä, kun se sitoutuu kaksijuosteiseen DNA:han. Kun PCR luo yhä enemmän DNA:ta, enemmän väriainemolekyylejä sitoutuu DNA:han tuottaen enemmän fluoresenssia. Siksi fluoresenssi lisääntyy PCR-tuotteen kertymisen myötä. Näin ollen PCR-tuotteen määrä voidaan mitata kvantitatiivisesti SYBR Green -fluoresenssidetektiolla.
SYBR vihreää väriainetta voidaan käyttää myös DNA-leimaukseen sytometriassa ja fluoresenssimikroskopiassa. Etidiumbromidi on korvattu onnistuneesti SYBR Greenillä, koska etidiumbromidi on syöpää aiheuttava väriaine, jonka hävittämisongelmia DNA:n visualisoinnin aikana geelielektroforeesissa.
SYBR vihreällä menetelmällä on etuja ja haittoja. Tämä menetelmä on erittäin herkkä, halpa ja helppokäyttöinen. Kuitenkin, koska se kykenee sitoutumaan mihin tahansa kaksijuosteiseen DNA:han, epäspesifinen sitoutuminen voi johtaa PCR-tuotteen liialliseen kvantifiointiin.
Kuva 01: SYBR Green Technique
Mikä Taqman on?
Taqman on vaihtoehtoinen menetelmä SYBR Greenille seurata reaaliaikaista PCR-prosessia. Tämä menetelmä riippuu Taq-polymeraasientsyymin 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuudesta, joka hajottaa koettimet uuden juosteen pidentämisen ja fluoroforin vapautumisen aikana. Tässä menetelmässä käytetään kaksoisleimattuja koettimia ja se perustuu koettimien hydrolyysiin. Koettimet ovat fluoresoivasti leimattuja DNA-oligonukleotideja, joiden 5'-päässä on fluoresoiva reportterimolekyyli (fluorofori) ja 3'-päässä sammuttajamolekyyli. Ne on suunniteltu sitoutumaan yksisäikeiseen mallineeseen alukkeen hehkutuksen vastakkaisella puolella. Taq-polymeraasi lisää nukleotideja alukkeeseen ja laajentaa uutta juostetta kohti kaksoisleimattuja koettimia. Kun Taq-polymeraasi kohtaa koettimen, Taq-polymeraasin eksonukleaasitoiminta aktivoi ja hajottaa koettimen. Kun se on saattanut uuden juosteen synteesin päätökseen, koetin altistetaan täydelliselle hajoamiselle ja vapauttaa fluoroforin. Fluoroforin vapautuminen synnyttää fluoresenssia. Fluoresoiva Quencher-molekyyli sammuttaa tehokkaasti säteilevän valon ja luo ulostulon PCR-tuotteen kvantifiointia varten. Fluoroforien vapautuminen ja PCR-tuotteiden määrä ovat verrannollisia. Näin ollen kvantifiointi voidaan tehdä helposti Taqman-menetelmällä.
Kuva 02: Taqman-menetelmä
Taqman-menetelmää käytetään reaaliaikaisessa PCR:ssä, geeniekspression kvantifiointiin, geneettisten polymorfismien havaitsemiseen, kromosomaalisten DNA-deleetioiden kvantifiointiin, bakteerien tunnistamiseen, microarray-analyysin varmentamiseen, SNP-genotyypitykseen jne.
Mitä eroa on SYBR greenin ja Taqmanin välillä?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green perustuu DNA:ta sitovaan väriaineeseen. | Taqman riippuu hybridisaatiokoettimista ja Taq-polymeraasin 5'-3' eksonukleaasiaktiivisuudesta. |
| Fluoresenssimerkityt anturit | |
| Fluoresoivasti merkittyjä koettimia ei tarvita. | Vaaditaan kaksoismerkityt anturit. |
| Multiplex-geenianalyysi | |
| Sitä ei voi käyttää multipleksigeenikohteisiin. | Voidaan käyttää multiplex-geenikohteisiin. |
| Kustannus | |
| Tämä on halvempaa. | Tämä on kalliimpi. |
| Spesifisyys | |
| Tämä on vähemmän spesifinen ja sitoutuu mihin tahansa kaksijuosteiseen DNA:han | Nämä ovat erittäin spesifisiä, koska anturit havaitsevat tietyt vahvistustuotteet. |
| Tehokkuus | |
| Tämä on vähemmän tehokas. | Tämä on erittäin tehokas. |
| Hakemus | |
| Tätä käytetään reaaliaikaisessa PCR:ssä, agaroosigeelivisualisoinnissa, DNA-leimauksessa jne. | Tätä käytetään reaaliaikaisessa PCR:ssä, geeniekspression kvantifiointiin, geneettisten polymorfismien havaitsemiseen jne. |
Yhteenveto – SYBR Green ja Taqman
Taqman ja SYBR green ovat kaksi menetelmää, joita käytetään reaaliaikaisessa PCR:ssä (kvantitatiivinen PCR). Molemmat menetelmät mahdollistavat PCR-tuotteen kvantifioinnin tehokkaasti ja perustuvat fluoresenssin emissioon. Taqman-menetelmässä käytetään kaksoisleimattuja koettimia kerääntyneen DNA:n havaitsemiseen, kun taas SYBR Green -menetelmässä käytetään fluoresoivaa väriainetta. Molemmilla menetelmillä on myös erilaisia sovelluksia molekyylibiologiassa.
