Avainero – Northern vs Southern vs Western Blotting
Spesifisten DNA-, RNA- ja proteiinisekvenssien havaitseminen on välttämätöntä erityyppisissä molekyylibiologian tutkimuksissa. Geelielektroforeesi on tekniikka, joka erottaa DNA:n, RNA:n ja proteiinit niiden koon mukaan. Geeliprofiileista havaitaan tietty DNA-sekvenssi, RNA-sekvenssi tai proteiini erityisillä tekniikoilla, joita kutsutaan blottingiksi ja hybridisaatioksi leimatuilla koettimilla. On olemassa kolme erilaista blot-menetelmää, nimittäin eteläinen, pohjoinen ja läntinen. Keskeinen ero northern southern ja western blottingin välillä on molekyylin tyyppi, jonka se havaitsee näytteestä. Southern blot on menetelmä, joka havaitsee tietyn DNA-sekvenssin DNA-näytteestä. Northern blotting on tekniikka, joka havaitsee spesifisen RNA-sekvenssin RNA-näytteestä. Western blot on menetelmä, joka havaitsee tietyn proteiinin proteiininäytteestä.
Mitä Southern Blotting on?
Southern blot -tekniikan kehitti E. M. Southern vuonna 1975 tietyn DNA-sekvenssin tunnistamiseksi DNA-näytteestä. Tämä on ensimmäinen molekyylibiologiassa käyttöön otettu blottaustekniikka. Se mahdollisti tiettyjen geenien havaitsemisen DNA:sta, tiettyjen fragmenttien DNA:sta jne. Southern blot -tekniikassa on useita vaiheita. Ne ovat seuraavat.
- DNA eristetään näytteestä ja pilkotaan restriktioendonukleaaseilla.
- Digestoitu näyte erotetaan agaroosigeelielektroforeesilla.
- DNA-fragmentit geelissä denaturoidaan yksittäisiksi säikeiksi käyttämällä alkalista liuosta.
- Yksijuosteinen DNA siirretään nitroselluloosasuodatinkalvolle kapillaarisiirrolla.
- Siirretty DNA kiinnittyy kalvoon pysyvästi.
- Kiinteä DNA kalvolla hybridisoidaan leimattujen koettimien kanssa.
- Sitoutumaton DNA pestään pois kalvolta pesemällä.
- Röntgenfilmi altistetaan kalvolle ja autoradiografia valmistetaan.
Southern blottausta sovelletaan molekyylibiologian eri näkökohtiin. Se on hyödyllinen RFLP-kartoituksessa, oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa, DNA-metylaatiossa geenien ilmentymisessä, mutatoituneiden geenien havaitsemisessa geneettisissä häiriöissä, DNA-sormenjälkien ottamisessa jne.
Kuva 01: Southern Blotting -tekniikka
Mitä Northern Blotting on?
Northern blotting on menetelmä, joka on suunniteltu havaitsemaan spesifinen RNA-sekvenssi tai mRNA-sekvenssi näytteestä geeniekspression tutkimiseksi. Tämän tekniikan kehittivät Alwine, Kemp ja Stark vuonna 1979. Se eroaa sourthern- ja western blotting -tekniikoista useiden vaiheiden vuoksi. Tämä tekniikka suoritetaan kuitenkin myös geelielektroforeesilla, blottauksella ja hybridisaatiolla spesifisillä leimatuilla koettimilla ja havaitsemisella. Northern blotting -tekniikka suoritetaan seuraavasti.
- RNA uutetaan näytteestä ja erotetaan geelielektroforeesilla.
- RNA siirretään geelistä imukalvolle ja kiinnitetään.
- Membraania käsitellään leimatulla koettimella, joka on valmistettu cDNA:sta tai RNA:sta (koetin on komplementaarinen tietylle näytteen sekvenssille).
- Koetinta inkuboidaan kalvon kanssa, jotta se sitoutuu tietyllä sekvenssillä.
- Sitoutumattomat anturit pestään pois.
- Hybridisoidut fragmentit havaitaan autoradiografilla.
Northern blotting on tärkeä työkalu hybridisoituneen mRNA:n havaitsemisessa ja kvantifioinnissa, RNA:n hajoamisen tutkimisessa, RNA:n puoliintumisajan arvioinnissa, RNA:n silmukoinnin havaitsemisessa, geenin ilmentymisen tutkimisessa jne.
Kuva 02: Northern Blotting
Mitä Western Blotting on?
Western blotting on menetelmä, jolla havaitaan tietty proteiini proteiiniseoksesta käyttämällä leimattua vasta-ainetta. Siksi Western blot tunnetaan myös immunoblottina. Tämän tekniikan esittelivät Towbin et al vuonna 1979, ja nyt se suoritetaan rutiininomaisesti laboratorioissa proteiinianalyysiä varten. Vaiheet ovat seuraavat.
- Proteiinit uutetaan näytteestä
- Proteiinit erotetaan koon mukaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla
- Erotetut molekyylit siirretään PVDF-kalvoon tai nitroselluloosakalvoon elektroporaatiolla
- Membraani on estetty epäspesifisestä sitoutumisesta vasta-aineisiin
- Siirretyt proteiinit sitoutuvat primääriseen vasta-aineeseen (entsyymileimatut vasta-aineet).
- Membraani pestään epäspesifisesti sitoutuneiden primääristen vasta-aineiden poistamiseksi
- Sitoutuneet vasta-aineet havaitaan lisäämällä substraattia ja havaitsemalla muodostunut värillinen sakka
Western blotting on hyödyllinen HIV-vasta-aineiden havaitsemisessa ihmisen seeruminäytteestä. Western blot -testiä voidaan käyttää myös hepatiitti B -infektion varmistustestinä ja hullun lehmän taudin lopullisena testinä.
Kuva 03: Western Blotting
Mitä eroa on Northern Southernin ja Western Blottingin välillä?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Havaittu molekyylityyppi | |
| Northern Blotting | Northern blotting havaitsee tietyn RNA-sekvenssin RNA-näytteestä. |
| Southern Blotting | Southern blotting havaitsee tietyn DNA-sekvenssin DNA-näytteestä. |
| Western Blotting | Western blotting havaitsee tietyn proteiinin proteiininäytteestä. |
| Geelin tyyppi | |
| Northern Blotting | Tämä käyttää agaroosi/formaldehydigeeliä. |
| Southern Blotting | Tässä käytetään agaroosigeeliä. |
| Western Blotting | Tässä käytetään polyakryyliamidigeeliä. |
| Blottausmenetelmä | |
| Northern Blotting | Tämä on kapillaarisiirto. |
| Southern Blotting | Tämä on kapillaarisiirto. |
| Western Blotting | Tämä on sähköinen siirto. |
| Käytetyt anturit | |
| Northern Blotting | cDNA- tai RNA-koettimet, jotka on leimattu radioaktiivisesti tai ei-radioaktiivisesti. |
| Southern Blotting | DNA-koettimet on leimattu radioaktiivisesti tai ei-radioaktiivisesti. |
| Western Blotting | Primäärisiä vasta-aineita käytetään koettimina. |
| Havaintojärjestelmä | |
| Northern Blotting | Tämä tehdään käyttämällä autoradiografia tai valon tai värin muutoksen havaitsemista. |
| Southern Blotting | Tämä tehdään käyttämällä autoradiografia, valon tai värin muutoksen havaitsemista. |
| Western Blotting | Tämä tehdään valon tai värin muutoksen havaitsemisen avulla. |
Yhteenveto – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting on erikoistekniikka, joka on kehitetty tietyn DNA:n, RNA:n tai proteiinin tunnistamiseen näytteistä. On olemassa kolme erillistä blot-menetelmää, nimittäin pohjoinen, eteläinen ja läntinen, tietyn tyyppisen molekyylin havaitsemiseksi. Northern blot -tekniikka on suunniteltu havaitsemaan spesifinen RNA-sekvenssi RNA-seoksesta. Southern blot -tekniikka mahdollistaa tietyn DNA-sekvenssin havaitsemisen DNA-näytteestä, ja Western blot -tekniikkaa kehitetään tietyn proteiinin tunnistamiseksi proteiiniseoksesta.
