Avainero – SDS-sivu vs Western Blot
Western blottaus on tekniikka, joka havaitsee tietyn proteiinin proteiininäytteestä. Tämä tekniikka suoritetaan useiden avainvaiheiden kautta: geelielektroforeesi, blottaus ja hybridisaatio. Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS Page) on eräänlainen geelielektroforeesitekniikka, jota käytetään proteiinien erottamiseen niiden koon (molekyylipainon) mukaan. Western blot on blot-kalvon erityinen arkki, jota käytetään siirtämään sama proteiinikuvio SDS-sivulla. Keskeinen ero SDS-sivun ja Western blotin välillä on, että SDS-sivu mahdollistaa proteiinien erottamisen seoksessa, kun taas Western blot mahdollistaa tietyn proteiinin havaitsemisen ja kvantifioinnin seoksesta. Molemmat ovat hyödyllisiä proteiinianalyysitutkimuksissa.
Mikä on SDS-sivu?
SDS Page on geelielektroforeesitekniikka, jota käytetään proteiinien erottamiseen. Sitä käytetään yleisesti biokemiassa, genetiikassa, oikeuslääketieteessä ja molekyylibiologiassa. Kun proteiinit on uutettu näytteestä, ne ajetaan geelillä, joka koostuu SDS:stä ja polyakryyliamidista. SDS on anioninen pesuaine, jota käytetään linearisoimaan proteiineja (denaturoimaan proteiineja) ja antamaan linearisoituihin proteiineihin niiden molekyylimassaan verrannollinen negatiivinen varaus. Polyakryyliamidista tulee kiinteä tuki geelille. Denaturoidut proteiinit, jotka ovat negatiivisesti varautuneet, kulkeutuvat kohti laitteen positiivista päätä geelin läpi. Proteiinien koon mukaan liikkumisnopeudet vaihtelevat proteiinien välillä ja tapahtuu erottumista. Siksi SDS-sivu on hyödyllinen yksittäisten proteiinien erottamiseen niiden koon perusteella.
Polyakryyliamidigeelin valmistus proteiinien fraktiointia varten on ratkaiseva vaihe SDS-sivulla. Oikea polyakryyliamidin pitoisuus ja käytetyn silloitusaineen tyyppi vaikuttavat voimakkaasti geelin fysikaalisiin ominaisuuksiin, mikä tekee eri proteiinien varsinaisen erottumisen. Geelin huokoskoot tulee hallita oikein tehokkaan erottamisen varmistamiseksi. SDS-sivua pidetään kuitenkin korkean resoluution proteiinien erotustekniikkana.
SDS-sivutekniikalla on suuri rajoitus proteiinianalyysissä. Koska SDS denaturoi proteiineja ennen erotusta, se ei salli entsymaattisen aktiivisuuden, proteiineihin sitoutuvien vuorovaikutusten, proteiinien kofaktorien jne. havaitsemista.
Kuva 01: SDS-sivu
Mikä Western Blot on?
Western blot -tekniikka mahdollistaa tietyn proteiinin havaitsemisen proteiiniseoksesta ja proteiinin määrän ja molekyylipainon mittaamisen. Western blot on kalvo, jota käytetään blot-menettelyn aikana peilikuvan saamiseksi SDS-polyakryyliamidigeelin proteiinikuvioista. Western blottaukseen käytetty kalvo koostuu enimmäkseen nitroselluloosasta tai polyvinylideenidifluoridista (PVDF). Kalvoa, jossa on siirretty proteiini, voidaan käyttää halutun proteiinin tunnistamiseen. Se vaatii korkealaatuista vasta-ainetta halutun proteiinin havaitsemiseksi hybridisaatiolla. Vasta-aine sitoutuu spesifiseen antigeeniinsä ja paljastaa halutun antigeenin, joka on proteiini, läsnäolon.
Proteiinien siirto SDS-polyakryyliamidigeelistä Western blot -analyysiin suoritetaan elektroblottauksella. Se on tehokas ja nopea menetelmä, joka saa proteiinit elektroforeesin poistumaan geelistä ja siirtymään nitroselluloosakalvolle (Western blot).
Kuva 02: Western Blot
Mitä eroa on SDS-sivulla ja Western Blotilla?
SDS-sivu vs Western Blot |
|
| SDS Page on geelielektroforeesitekniikka. | Western blot on tekniikka, joka suoritetaan kalvolla tietyn proteiinin havaitsemiseksi seoksesta. |
| Käytä | |
| SDS-sivu mahdollistaa proteiinien erottamisen niiden koon mukaan. | Western blot mahdollistaa proteiinien siirtämisen SDS-sivugeelissä muuttamatta sen kuviota ja mahdollistaa hybridisaation tiettyjen vasta-aineiden kanssa. |
| Haitat | |
| Proteiinin denaturaatio, korkea hinta ja hermomyrkkykemikaalien esiintyminen ovat tämän tekniikan haittoja. | Tämä tekniikka on aikaa vievä ja vaatii hyvän kokeneen henkilökohtaisen ja erityiset valvotut olosuhteet. |
Yhteenveto – SDS-sivu vs Western Blot
SDS-sivu ja Western blot ovat kaksi menetelmää, jotka liittyvät proteiinianalyysiin. SDS-sivu mahdollistaa proteiinien helpon erottamisen geelissä niiden molekyylipainon mukaan. Western blot auttaa varmistamaan tietyn proteiinin läsnäolon ja määrän hybridisoimalla spesifisten vasta-aineiden kanssa. Tämä on ero SDS-sivun ja Western blotin välillä.
