Avainero – T4 vs T7 DNA Ligaasi
DNA-ligaasi on tärkeä entsyymi, jota käytetään molekyylibiologian tekniikoissa. Se toimii molekyyliliimana nukleotidien yhdistämiseksi muodostamalla fosfodiesterisidoksia nukleotidien välille. Fosfodiesterisidokset muodostuvat sokeriosan 3'-hydroksyylipään ja 5'-pään fosfaattiryhmän väliin. DNA-ligaasi on elintärkeä replikaatioprosessissa liittymään jäljessä olevan juosteen Okazaki-fragmentteihin ja DNA-korjausmekanismien ja in vitro -kloonauskokeiden aikana halutun kiinnostavan geenin liittämiseksi vektorin genomiin. Molekyylibiologit käyttävät tällä hetkellä kahta pääasiallista DNA-ligaasia: T4- ja T7-DNA-ligaaseja. T4-DNA-ligaasi on yksi ensimmäisistä entsyymeistä, jotka on eristetty T4-bakteriofagista. T7 DNA-ligaasi, joka on pienempi proteiini, on entsyymi, joka on eristetty T7-bakteriofagista. Tämä on tärkein ero T4- ja T7-DNA-ligaasien välillä.
Mikä on DNA-ligaasin vaikutus?
DNA-ligaatio tapahtuu kolmivaiheisessa reaktiossa. Ensimmäinen vaihe on nukleofiilinen hyökkäys ATP:n alfa-fosforia vastaan, jolloin syntyy kovalenttinen entsyymi-adenylaattivälituote, jossa AMP on kytketty lysiinin terminaaliseen sivuketjun typpeen. Toisessa vaiheessa tapahtuu nukleofiilinen hyökkäys entsyymi-adenylaatin fosforia vastaan 5'-fosfaattipäätteisen DNA-substraatin toimesta, vapauttaen lysiiniä ja muodostaen DNA-adenylaattia. Viimeisessä vaiheessa toisen DNA-juosteen 3'-OH hyökkää DNA-adenylaattiin, vapauttaen AMP:n ja yhdistäen polynukleotidit.
Mikä on T4 DNA Ligaasi?
T4-ligaasi oli ensimmäinen ligaasi, jonka Meselson, Weigle ja Kellenberger eristivät ja tunnistivat, ja se oli ensimmäinen kaupallinen ligaasi, jonka tuotettiin. T4 DNA-ligaasi on ATP-riippuvainen entsyymi, joka katalysoi fosfodiesterisidoksen muodostumista. Se on yksi polypeptidiketju, jossa on 487 aminohappotähdettä ja jonka molekyylipaino on noin 77 kDa. Sen aktiivisuuden optimaalinen pH on välillä 7,5 – 8.
Kuva 01: T4 DNA Ligaasi
T4 DNA-ligaasi, kuten sen nimi ehdottaa, on läsnä bakteriofagissa T4 ja se eristettiin, kun faagi tuotti entsyymiä E. coli -infektion jälkeen. Entsyymi ligatoi kaksijuosteisia DNA-duplekseja, joissa on tylppäpäiset päät, ja sidottavien fragmenttien tulee olla lähellä toisiaan.
Mikä on T7 DNA Ligaasi?
T7-ligaasi on 41 kDa:n proteiini, jota tuottaa T7 Bacteriophage, ja se eristetään infektoimalla E. coli -soluja. T7-ligaasin päätehtävä on ligatoida DNA-duplekseja fosfodiesterisidosten kautta ja liittää läheiset DNA-fragmentit kloonauskokeiden aikana. Optimaalinen pH T7 DNA-ligaasille on välillä 7,0 – 7,2. T7-ligaasi on ATP-riippuvainen. T7-DNA-ligaasit pystyvät myös pariutumaan DNA- ja RNA-hybrideihin, mikä aiheuttaa epänormaaleja konformaatioita transkription aikana; tätä ilmiötä tutkitaan kuitenkin edelleen in vitro -tutkimuksilla.
Mitä yhtäläisyyksiä T4- ja T7-DNA-ligaasien välillä on?
- T4 ja T7 DNA-ligaasi osallistuvat ligaatioreaktioon liittämällä DNA-duplekseja fosfodiesterisidoksen muodostumisen kautta DNA-fragmentin 3' OH-pään ja 5' fosfaattipään välille.
- Molemmat entsyymit ligatoivat tylppäpäisiä DNA-duplekseja, jotka ovat lähellä toisiaan.
- Molemmat entsyymit ovat ATP-riippuvaisia.
- Nämä entsyymit eristetään infektoimalla E. coli -soluja tietyllä bakteriofagilla.
- Molempien entsyymien sovelluksia ovat:
- Molekylaarinen kloonaus – kiinnostavan geenin liittäminen vektoriin
- DNA-korjaus – kaksisäikeisten markkinarakojen korjaamiseen
- In vitro DNA:n replikaatio
- Ligaasiketjureaktio
Mitä eroa on T4- ja T7-DNA-ligaasien välillä?
T4 vs T7 DNA Ligaasi |
|
| T4 DNA Ligaasi -tyyppinen DNA-ligaasi, joka on eristetty bakteriofagi T4:stä ja osallistuu viereisten DNA-fragmenttien liittämiseen fosfodiesterisidoksen muodostumisen kautta. | T7 DNA Ligaasi -tyyppinen DNA-ligaasi, joka on eristetty bakteriofagi T7:stä ja osallistuu viereisten DNA-fragmenttien ligaatioon fosfodiesterisidoksen muodostumisen kautta. |
| Proteiinin koko | |
| T4 DNA-ligaasin koko on 77 kDa – suurempi kuin T7 DNA-ligaasissa. | T7 DNA-ligaasin koko on 41 kDa. |
| Optimaalinen pH | |
| pH-alue, joka toimii T4 DNA-ligaasilla, on 7,5 – 8,0. | pH-alue, joka toimii T7 DNA-ligaasilla, on 7,0 – 7,2. |
Yhteenveto – T4 vs T7 DNA Ligaasi
DNA-ligaasit ovat tärkeä entsyymiluokka, joka osallistuu molekyylikloonaukseen kiinnostavan geenin sisältävien yhdistelmä-DNA-molekyylien tuottamiseksi. Ligaatioreaktio on energiaa hyödyntävä reaktio, ja meneillään on uusia tutkimuksia tarkkuuden parantamiseksi moduloimalla saatavilla olevia ligaaseja. T4- ja T7-DNA-ligaasit ovat kahden tyyppisiä tärkeitä DNA-ligaasientsyymejä, joita käytetään molekyylibiologisissa tekniikoissa. T7 DNA-ligaasi on myös tulos tutkimuksesta, joka perustui primaariseen ligaasiin, joka oli eristetty T4-infektoituneesta E. colista. T7 on kuvattu tehokkaammin ja tarkemmin suorittaessaan tehtävänsä pienemmän koonsa ansiosta. Tämä on ero T4- ja T7-ligaasin välillä.
Lataa PDF-versio T4 vs T7 DNA Ligase
Voit ladata tämän artikkelin PDF-version ja käyttää sitä offline-tarkoituksiin lainaushuomautuksen mukaisesti. Lataa PDF-versio tästä Ero T4:n ja T7 Ligasen välillä.
