Avainero – Maxam Gilbert vs Sanger Sekvensointi
Nukleotidit ovat DNA:n perusrakenneyksiköitä ja rakennuspalikoita. DNA-molekyyli koostuu polynukleotidiketjusta. DNA:sta löytyy neljä erilaista nukleotidiä. Nämä nukleotidit koostuvat neljästä erilaisesta typpipitoisesta emäksestä nimeltä A (adeniini), G (guaniini), C (sytosiini), T (tymiini). Nukleotidien järjestyksellä DNA-molekyylissä on suuri merkitys, koska se koodaa tärkeää geneettistä informaatiota organismien kasvulle ja kehitykselle. DNA-sekvensointi viittaa prosessiin, joka määrittää DNA:n tarkan nukleotidisekvenssin. On olemassa erilaisia DNA-sekvensointimenetelmiä. Maxam Gilbertin sekvensointi ja Sangerin DNA-sekvensointi ovat kaksi DNA-sekvensointimenetelmää, jotka kuuluvat ensimmäisen sukupolven sekvensointiin. Maxam Gilbertin sekvensointimenetelmä määrittää emässekvenssin katkaisemalla kemiallisesti 5'-pään leimatut DNA-fragmentit ensisijaisesti jokaisessa neljässä nukleotidissa ja geelielektroforeesilla. Sangerin sekvensointimenetelmä määrittää nukleotidisekvenssin syntetisoimalla yksijuosteista DNA:ta käyttämällä DNA-polymeraasia ja dideoksinukleotideja ja geelielektroforeesia. Tämä on avainero Maxam Gilbertin ja Sanger Sequencingin välillä.
Mikä on Maxam Gilbert -sekvensointi?
Maxam Gilbertin sekvensointi, joka tunnetaan myös nimellä kemiallinen sekvensointimenetelmä, on tekniikka, joka kehitettiin DNA:n nukleotidien järjestyksen määrittämiseen. W alter Gilbert ja Alan Maxam esittelivät tämän menetelmän vuonna 1976, ja siitä tuli suosittu, koska se voidaan suorittaa suoraan puhdistetulla DNA:lla. Maxam Gilbert -menetelmä kuuluu DNA-sekvensoinnin ensimmäiseen sukupolveen, ja se oli ensimmäinen tutkijoiden laajasti käyttämä sekvensointimenetelmä.
Tämän menetelmän perusperiaate on pääteleimattujen DNA-fragmenttien rajoittaminen spesifisissä emäksissä emässpesifisillä kemikaaleilla ja olosuhteissa ja leimattujen fragmenttien erottaminen elektroforeesilla kuvan 01 mukaisesti. Fragmentit erotetaan geelin kokoon. Koska fragmentit on leimattu, DNA-molekyylin sekvenssi voidaan päätellä helposti.
Maxam Gilbert -menetelmä käyttää emässpesifisiä kemikaaleja DNA:n rikkomiseen tietyissä emäksissä. Kahta yleistä kemikaalia, dimetyylisulfaattia ja hydratsiinia, käytetään puriinien ja pyrimidiinien selektiiviseen hyökkäämiseen.
Maxam Gilbertin sekvensointimenetelmä suoritetaan useiden vaiheiden kautta seuraavasti.
- DNA-sekvenssin puhdistus restriktioendonukleaaseilla
- DNA-fragmenttien päiden merkitseminen lisäämällä radioaktiivisia fosfaatteja
- Leimattujen fragmenttien puhdistaminen leimaamattomista fragmenteista geelielektroforeesilla
- Päällä leimatun DNA:n erottaminen neljään putkeen ja käsittely emässpesifisillä kemikaaleilla erikseen
- Jokaisen putken sisällön elektroforeesi erillisillä viivoilla geelillä ja fragmenttien erottelu niiden pituuden mukaan.
- Fragmenttien havaitseminen autoradiografialla.
Kuva 01: Maxam Gilbert -sekvensointi
Mitä Sanger-sekvensointi on?
Sanger Sekvensointi on Frederick Sangerin ja hänen kollegoidensa vuonna 1977 kehittämä sekvensointimenetelmä tietyn DNA-fragmentin emässekvenssin määrittämiseksi. Se tunnetaan myös nimellä ketjun lopetussekvensointi tai dideoksisekvensointimenetelmä. Tämä menetelmä toimii periaatteella, että ketjun päättävien dideoksinukleotidien (ddNTP:t), kuten ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP, selektiivinen sisällyttäminen DNA-polymeraasin toimesta yksijuosteisen DNA:n synteesin aikana juosteen muodostumisen lopettamiseksi. Dideoksinukleotideistä puuttuu 3' OH-ryhmiä fosfodiesterisidosten muodostamiseksi viereisen nukleotidin kanssa. Näin ollen juosteen muodostuminen pysähtyy, kun ddNTP liitetään uuteen muodostuvaan juosteeseen sanger-sekvensoinnin aikana.
Tässä menetelmässä neljä erillistä DNA-synteesireaktiota (PCR) suoritetaan neljässä erillisessä putkessa yhden tyypin ddNTP:llä. Muita vaatimuksia toimitetaan myös PCR-putkille, mukaan lukien alukkeet, dNTP:t, Taq-polymeraasi, erityisolosuhteet jne. Neljä erillistä reaktiota suoritetaan neljässä putkessa neljällä seoksella. PCR-reaktioiden jälkeen saadut DNA-fragmentit lämpödenaturoidaan ja erotetaan geelielektroforeesilla. Sitten fragmentit visualisoidaan käyttämällä joko leimattua (radioaktiivista tai fluoresoivaa) aluketta tai dNTP:itä kuvan 02 mukaisesti.
Kuva 02: Sanger-sekvensointi
Mitä eroa on Maxam Gilbertin ja Sanger Sequencingin välillä?
Maxam Gilbert vs Sanger Sekvensointi |
|
| Maxam Gilbertin sekvensointi on ensimmäinen DNA-sekvensointiin kehitetty tekniikka. | Sangerin sekvensointimenetelmä otettiin käyttöön Maxam Gilbertin sekvensointimenetelmän jälkeen. |
| Käyttö | |
| Tätä menetelmää käytetään harvoin. | Sanger-sekvensointia käytetään rutiininomaisesti sekvensointiin. |
| Vaarallisten kemikaalien käyttö | |
| Se käyttää vaarallisia kemikaaleja. | Vaarallisten kemikaalien käyttö on rajoitettua Maxam Gilbertin menetelmään verrattuna. |
| Etsinnän merkitseminen | |
| Tässä menetelmässä käytetään radioaktiivista P32 DNA-fragmenttien päiden leimaamiseen. | Sanger-sekvensointi käyttää radioaktiivisesti tai fluoresoivasti leimattuja ddNTP:itä. |
Yhteenveto – Maxam Gilbert vs Sanger Sekvensointi
Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensointi ovat kahden tyyppisiä DNA-sekvensointitekniikoita, jotka kuuluvat ensimmäisen sukupolven DNA-sekvensointiin. Maxam Gilbert -sekvensointi on ensimmäinen DNA-sekvensointimenetelmä, joka otettiin käyttöön vuonna 1976, ja se suoritetaan rikkomalla päätemerkityt DNA-fragmentit emässpesifisillä kemikaaleilla. Siksi se tunnetaan nimellä kemiallinen sekvensointi. Sangerin sekvensointimenetelmä otettiin käyttöön vuonna 1977, ja se perustuu ddNTP-ohjattuihin ketjun lopetusreaktioihin. Sanger-sekvensointimenetelmä suosittu kuin Maxam Gilbert -menetelmä, johtuen useista Maxam Gilbert -menetelmän haitoista, kuten liiallisesta ajankulutuksesta, vaarallisten kemikaalien käytöstä jne. Tämä on ero Maxam Gilbertin ja Sangerin sekvensoinnin välillä.
