Avainero – PCR vs DNA-sekvensointi
PCR ja DNA-sekvensointi ovat kaksi tärkeää tekniikkaa molekyylibiologiassa. Polymeraasiketjureaktio (PCR) on prosessi, joka luo suuren määrän kopioita DNA-fragmentista. DNA-sekvensointi on tekniikka, joka johtaa tietyn DNA-fragmentin nukleotidien tarkkaan järjestykseen. Tämä on avainero PCR- ja DNA-sekvensoinnin välillä. PCR on yksi tärkeimmistä DNA-sekvensoinnin vaiheista.
Mikä on PCR?
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on DNA:n monistustekniikka, jota käytetään molekyylibiologiassa. Se tuottaa tuhansia tai miljoonia kopioita tietystä DNA-fragmentista. Tämän menetelmän kehitti Kary Mullis vuonna 1983. Tässä tekniikassa monistettava DNA-fragmentti toimii templaattina ja DNA-polymeraasientsyymi lisää komplementaarisia nukleotideja alukkeeseen, joka on saatavilla PCR-seoksessa. PCR-reaktion lopussa syntetisoidaan useita kopioita näyte-DNA:sta.
PCR-seoksessa on erilaisia komponentteja, mukaan lukien DNA, DNA-polymeraasi (Taq-polymeraasi), alukkeet (forward- ja reverse-alukkeet), nukleotidit (DNA:n rakennuspalikoita) ja puskuri. PCR tapahtuu PCR-koneen sisällä, ja oikea PCR-seos tulee ladata koneeseen ja oikea ohjelma tulee ajaa. Tämä tekniikka mahdollistaa tuhansien tai miljoonien kopioiden valmistamisen tietystä DNA:n osasta hyvin pienestä DNA-määrästä.
PCR-reaktiot tapahtuvat syklisesti tuottaen näkyvän määrän PCR-tuotteita geelille. PCR-reaktiossa on kolme päävaihetta, nimittäin denaturaatio, alukkeen pariutuminen ja juosteen pidentäminen, kuten kuvassa 01 esitetään. Nämä kolme vaihetta tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa. DNA esiintyy kaksijuosteisessa muodossa komplementaaristen emästen välisten vetysidosten kautta. Ennen implikaatiota kaksijuosteiset DNA:t tulisi erottaa toisistaan. Se tehdään antamalla korkea lämpötila. Korkeassa lämpötilassa kaksijuosteinen DNA denaturoituu yksittäisiksi juosteiksi. Sitten alukkeiden tulisi tulla lähemmäksi spesifisen fragmentin tai DNA:n geenin viereisiä päitä. Aluke on lyhyt yksijuosteisen DNA:n pala, joka on komplementaarinen kohdesekvenssin kanssa. Forward- ja reverse-alukkeet pariutuvat komplementaaristen emästen kanssa denaturoidun näyte-DNA:n viereisissä päissä pariutumislämpötilassa. Pohjusteiden tulee olla lämmönkestäviä. Kun alukkeet pariutuvat näyte-DNA:n kanssa, taq-polymeraasientsyymi aloittaa uusien juosteiden synteesin lisäämällä nukleotideja, jotka ovat komplementaarisia kohde-DNA:n kanssa. Taq-polymeraasi on lämpöstabiili entsyymi, joka on eristetty termofiilisestä bakteerista nimeltä Thermus aquaticus. PCR-puskuri ylläpitää optimaaliset olosuhteet taq-polymeraasitoiminnalle. Nämä kolme PCR-reaktioiden vaihetta toistetaan tarvittavan määrän PCR-tuotetta tuottamiseksi. Jokaisen PCR-reaktion jälkeen DNA-kopion lukumäärä kaksinkertaistetaan. Tästä syystä PCR:ssä voidaan havaita eksponentiaalinen monistuminen. PCR-tuotteita voidaan tarkkailla geelielektroforeesilla ja ne voidaan puhdistaa jatkotutkimuksia varten.
Kuva 01: PCR-reaktion tärkeimmät vaiheet
PCR on arvokas työkalu lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. PCR:llä on erityinen arvo oikeuslääketieteellisessä tieteessä, koska se voi monistaa DNA:ta tutkimuksia varten rikollisten pienistä näytteistä ja tehdä rikosteknisiä DNA-profiileja. PCR:ää käytetään laaj alti monilla molekyylibiologian aloilla, mukaan lukien genotyypit, geenikloonaus, mutaatioiden havaitseminen, DNA-sekvensointi, DNA-mikrosirut ja isyystestaukset jne.
Kuva 02: Polymeraasiketjureaktio
Mitä DNA-sekvensointi on?
DNA-sekvensointi on nukleotidien – adeniinin, guaniinin, sytosiinin ja tymiinin – tarkan järjestyksen määrittämistä tietyssä DNA-fragmentissa. Geneettinen tieto tallennetaan DNA-sekvensseihin käyttäen oikeaa nukleotidijärjestystä. Siksi DNA-fragmentin nukleotidien tarkan järjestyksen löytäminen on erittäin tärkeää tietää geenien rakenne ja toiminta.
DNA-sekvensointiprotokolla sisältää erilaisia prosesseja. Ensimmäinen vaihe on organismin kiinnostuneen DNA:n tai genomisen DNA:n eristäminen. Käyttämällä PCR:ää (kuten yllä on kuvattu) haluttu DNA-alue tulisi monistaa. Monistettu PCR-tuote tulee erottaa geelielektroforeesilla ja puhdistaa. Monistetut fragmentit toimivat sekvensoinnin templaatteina. Sekvensointi voidaan tehdä joko seuraamalla Sanger-sekvensointia tai korkean suorituskyvyn sekvensointimenetelmää. Sanger-sekvensointi vaatii tuloksena olevien DNA-fragmenttien kapillaarielektroforeesia. Oikea nukleotidijärjestys voidaan määrittää lukemalla autoradiografit manuaalisesti tai käyttämällä automaattisia DNA-sekvenssereitä.
Geenisekvensointi vaikutti Human genomi -projektiin ja helpotti ihmisen genomin kartoittamista vuonna 2003. Oikeuslääketieteessä DNA-sekvensointi mahdollisti yksilöiden tunnistamisen, jotka osoittavat ainutlaatuisia DNA-sekvenssejä ja tunnistavat rikolliset. Lääketieteessä DNA-sekvensoinnilla voidaan havaita geneettisistä ja muista sairauksista vastuussa olevat geenit, löytää viallisia geenejä ja korvata ne oikeilla geeneillä. Maataloudessa joidenkin mikro-organismien DNA-sekvensointitietoja käytetään tuottamaan siirtogeenisiä kasveja, joilla on taloudellisesti toivottuja ominaisuuksia.
Kuva 03: DNA-sekvensointi
Mitä eroa on PCR:n ja DNA-sekvensoinnin välillä?
PCR vs DNA-sekvensointi |
|
| PCR-prosessi luo tuhansia tai miljoonia kopioita kiinnostuneesta DNA-fragmentista. | DNA-sekvensointi on prosessi, jossa määritetään nukleotidien tarkka järjestys tietyssä DNA-fragmentissa. |
| Tulos | |
| PCR luo tuhansia tai miljoonia kopioita tietystä DNA-fragmentista | Tämä johtaa emästen oikeaan järjestykseen tietyssä DNA-fragmentissa. |
| ddNTP:n osallistuminen | |
| PCR ei vaadi ddNTP:itä. Se käyttää dNTP:itä. | DNA-sekvensointi vaatii ddNTP:t lopettamaan juosteen muodostumisen. |
Yhteenveto – PCR vs DNA-sekvensointi
PCR ja DNA-sekvensointi ovat erittäin tärkeitä työkaluja monilla molekyylibiologian alueilla. DNA-fragmenttien monistus tehdään PCR-tekniikalla, kun taas DNA-fragmentin nukleotidien oikea järjestys määräytyy DNA-sekvensoinnin avulla. Tämä on ero PCR:n ja DNA-sekvensoinnin välillä.
