Avainero – Eteenpäin vs. Reverse Primer
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on DNA:n monistusmenetelmä, jota käytetään molekyylibiologisissa sovelluksissa. Se on yleisesti käytetty tekniikka, joka tekee miljoonista miljardeihin kopioita erityisen kiinnostavasta DNA-sekvenssistä. Se on laboratorioissa suoritettava in vitro -menetelmä. PCR-tekniikka on täysin riippuvainen kaupallisesti tuotetusta DNA-polymeraasista, jota kutsutaan Taq-polymeraasiksi. Se vaatii myös useita muita komponentteja ja asianmukaista lämpötilan ylläpitoa. Yksi tärkeä komponentti on pohjamaalit. Alukkeet ovat lyhyitä DNA-sekvenssejä, jotka on erityisesti suunniteltu kohde-DNA-sekvenssiä varten. Ne ovat yleensä noin 20 nukleotidin pituisia. Taq-polymeraasi katalysoi nukleotidien lisäämistä olemassa olevaan nukleotidisekvenssiin. Näin ollen alukkeet toimivat uusien säikeiden synteesin lähtökohtina. Taq-polymeraasi toimii vain 5' - 3' suunnassa, joten DNA-synteesi tapahtuu samassa 5' - 3' suunnassa. Koska DNA on kaksijuosteinen, PCR:ssä tarvitaan kahden tyyppisiä alukkeita. Ne tunnetaan etu- ja käänteisalukkeina. Forward- ja reverse-alukkeet kutsutaan DNA:ssa olevan alukkeen pidentymissuunnan perusteella, kun DNA-synteesi tapahtuu. Eteenpäin suuntautuva aluke pariutuu antisense-DNA-juosteen kanssa ja käynnistää geenin +ve-juosteen synteesin 5'-3'-suunnassa. Käänteinen aluke pariutuu sense-juosteen kanssa ja käynnistää koodaavan juosteen komplementaarisen juosteen synteesin; joka on -ve geenin juoste 5'-3' suuntaan. Tämä on avainero eteenpäin ja käänteisen alukkeen välillä.
Mikä on Forward Primer?
Eteenpäin suuntautuminen on geenin koodaavan juosteen tai sense-juosteen synteesi. Taq-polymeraasi katalysoi uuden juosteen synteesiä 5'-3' suunnassa. Koodaavan juosteen synteesi tapahtuu, kun aluke pariutuu ei-koodaavan tai antisense-juosteen kanssa ja pitenee 5' - 3' suunnassa.
Kuva 01: Eteenpäin ja taaksepäin alukkeet
Aluke, joka pariutuu antisense-juosteen tai ei-koodaavan juosteen tai templaattijuosteen kanssa, tunnetaan eteenpäin-alukkeena, koska eteenpäin suuntautuva aluke toimii lähtökohtana geenin koodaavan tai positiivisen juosteen synteesille. Forward-alukkeella on lyhyt nukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen antisense-juosteen 3'-reunustavan pään kanssa. Se hybridisoituu antisense-juosteen kanssa ja helpottaa Taq-polymeraasia lisäämään nukleotideja, jotka ovat komplementaarisia templaattijuosteen kanssa.
Mikä on käänteinen pohjamaali?
Käänteinen aluke on lyhyt DNA-sekvenssi, joka pariutuu sense-juosteen tai koodaavan juosteen 3'-pään kanssa. Käänteinen aluke toimii lähtökohtana koodaavan sekvenssin tai ei-koodaavan sekvenssin komplementaarisen juosteen syntetisoimiseksi. Käänteinen aluke on suunniteltu täydentämään koodaavan juosteen 3'-päätä. Siten se pariutuu koodaavan juosteen viereisen 3'-pään kanssa ja sallii Taq-polymeraasin syntetisoida antisense-juosteen tai templaattijuosteen. Koska sen suunta on käänteinen, tämä aluke on merkitty käänteiseksi alukkeeksi.
Sekä käänteiset että eteenpäin alukkeet ovat tärkeitä miljoonien tai miljardien kopioiden tuottamiseksi tietyistä kohdistetuista tai kiinnostuneista DNA-alueista.
Mitä yhtäläisyyksiä eteenpäin- ja käänteisalustalla on?
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet on valmistettu oligonukleotideista.
- Sekä etu- että käänteisalukkeilla on lyhyt nukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen DNA:n kaksoisjuosteiden viereisille päille.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet koostuvat yleensä 20 nukleotidista.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeita käytetään polymeraasiketjureaktioissa.
- Sekä Forward- että Reverse Primerit syntetisoidaan kaupallisesti.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet ovat lämpötilastabiileja ja niillä on normaalisti samanlainen Tm.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet on pariutunut kohde-DNA-sekvenssien kanssa.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet on suunniteltu PCR-reaktioiden mukaan.
- Sekä Forward- että Reverse-alukkeet toimivat DNA-monistuksen lähtöpisteinä.
- Sekä käänteiset että eteenpäin suunnatut alukkeet ovat tärkeitä tuottaessa miljoonia kopioita tietyistä kohdistettujen tai kiinnostuneiden DNA-sekvenssien alueista.
Mitä eroa on eteenpäin ja taaksepäin pohjusteella?
Forward Primer vs Reverse Primer |
|
| Eteenpäin suuntautuva aluke on lyhyt DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu geenin ei-koodaavan tai templaattijuosteen 3'-pään kanssa ja toimii lähtökohtana koodaavan sekvenssin syntetisoinnissa. | Käänteinen aluke on lyhyt DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu koodaavan tai ei-templaattijuosteen 3'-pään kanssa ja toimii lähtökohtana ei-koodaavan sekvenssin syntetisoinnissa. |
| Hehkutusnauha | |
| Eteenpäin pohjamaali hehkuu mallisäikeellä. | Käänteinen pohjamaali hehkuu ei-template-säikeellä. |
| Tuloksena uusi sekvenssi | |
| Eteenpäin suuntautuva aluke helpottaa koodaavan sekvenssin synteesiä. | Käänteinen aluke helpottaa koodaamattoman sekvenssin synteesiä. |
Yhteenveto – Eteenpäin vs. Reverse Primer
PCR-tekniikkaan liittyy kahdenlaisia alukkeita. Ne ovat eteenpäin ja taaksepäin alukkeita. Perustuen alukkeen pidentymiseen uuden DNA-juosteen synteesissä, nämä alukkeet on leimattu tai nimetty. Taq-polymeraasi syntetisoi uutta DNA:ta 5'-3'-suunnassa. Tästä syystä alukkeet on suunniteltu täydentämään kaksoissäikeiden 3' päitä. Forward-aluke, joka pitenee 5'-3'-suunnassa, hybridisoituu antisense- tai templaatin tai ei-koodaavan sekvenssin 3'-pään kanssa. Se toimii lähtökohtana koodaussekvenssin syntetisoinnissa. Käänteinen aluke, joka pitenee 5'-3'-suunnassa, hybridisoituu koodaavan tai ei-templaatin tai sense-juosteen 3'-pään kanssa. Se toimii lähtökohtana koodaamattoman sekvenssin syntetisoinnissa. Tämä on ero eteenpäin ja käänteisen alukkeen välillä.
