Avainero tavanomaisten sisäkkäisten ja reaaliaikaisten PCR-määritysten välillä on, että tavanomainen PCR on tekniikka, joka on kehitetty monistamaan spesifisiä DNA-sekvenssejä, ja nested-PCR on tavanomaisen PCR:n muunnos, joka koostuu kahdesta peräkkäisestä monistusreaktiosta, kun taas todellinen -time PCR on muunnelma tavanomaisesta PCR:stä, joka pystyy kvantifioimaan monistetun tuotteen.
PCR on hyvin yleinen tieteellinen tekniikka, jota käytetään laajasti tutkimuksessa ja lääketieteessä DNA:n havaitsemiseen. PCR-testejä käytetään antigeenien havaitsemiseen havaitsemalla niiden DNA tai RNA. Yleensä virus-RNA on läsnä kehossa ennen vasta-aineiden havaitsemista tai taudin oireiden ilmenemistä. PCR-testi voi kertoa, onko jollakulla virus varhain. Tällä hetkellä PCR on vakiotesti COVID-19-taudin havaitsemiseksi. On olemassa erilaisia PCR-tekniikoita, kuten reaaliaikainen PCR, sisäkkäinen PCR, multipleksinen PCR, hot start PCR ja pitkän kantaman PCR jne.
Mitä ovat tavanomaiset PCR-määritykset?
Perinteinen PCR-määritys on in vitro DNA:n monistustekniikka, joka suoritetaan rutiininomaisesti molekyylibiologisissa laboratorioissa. Tämä menetelmä mahdollisti tuhansien tai miljoonien kopioiden tuotannon tietystä DNA-fragmentista. Kary Mullis esitteli tämän tekniikan vuonna 1980. Tämä tekniikka vaatii DNA-fragmentin, joka tunnetaan nimellä templaatti, jotta siitä voidaan tehdä monia kopioita. Taq-polymeraasi toimii DNA-polymeraasientsyyminä ja katalysoi templaattisekvenssin uusien juosteiden synteesiä.
PCR-seoksen alukkeet toimivat fragmenttien pidennysten lähtöpisteinä. Kaikki DNA-kopioiden tekemiseen tarvittavat ainesosat sisältyvät PCR-seokseen. PCR-reaktio suoritetaan PCR-koneessa, ja siihen tulee syöttää oikea PCR-seos ja oikea PCR-ohjelma. Jos reaktioseos ja ohjelma ovat oikein, se tuottaa tarvittavan määrän kopioita tietystä DNA:n osasta hyvin pienestä DNA-määrästä.
Kuva 01: Perinteinen PCR-määritys
PCR-reaktiossa on kolme päävaihetta: denaturaatio, alukkeen pariutuminen ja juosteen pidentäminen. Nämä kolme vaihetta tapahtuvat kolmessa eri lämpötilassa. PCR-puskuri ylläpitää optimaaliset olosuhteet Taq-polymeraasitoiminnalle. Nämä kolme PCR-reaktion vaihetta toistetaan tarvittavan määrän PCR-tuotetta tuottamiseksi. Jokaisessa PCR-reaktiossa DNA-kopioiden määrä kaksinkertaistuu. Tästä syystä PCR:ssä voidaan havaita eksponentiaalinen monistuminen. PCR-tuote voidaan erottaa geelielektroforeesilla, koska se tuottaa näkyvän määrän DNA:ta geelille ja se voidaan puhdistaa lisätutkimuksia, kuten sekvensointia, varten.
PCR on arvokas työkalu lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. Erityisesti oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa PCR:llä on v altava arvo, sillä se voi monistaa DNA:ta rikollisten pienistä näytteistä tutkimuksia varten ja tehdä rikosteknisiä DNA-profiileja. PCR:ää käytetään laaj alti monilla molekyylibiologian aloilla, mukaan lukien genotyypit, geenikloonaus, mutaatioiden havaitseminen, DNA-sekvensointi, DNA-mikrosirut ja isyystestaukset.
Mitä ovat Nested PCR -määritykset?
Nested PCR on PCR-tyyppi, joka vähentää DNA:n epäspesifistä monistumista. Nested PCR -määrityksessä on kaksi peräkkäistä PCR:ää tai kaksi peräkkäistä monistusreaktiota. Ensimmäisen monistusreaktion aikana tuotetaan PCR-tuote. Ensimmäisen reaktion jälkeen suoritetaan toinen monistusreaktio ensimmäisen reaktion PCR-tuotteelle. Siksi alukkeet toisessa reaktioseoksessa sitoutuvat ensimmäiseen PCR-tuotteeseen ja monistavat sitä.
Kuva 02: Sisäkkäinen PCR
Alukeparit ovat erilaisia jokaisessa reaktiossa. Alukkeiden epäspesifinen sitoutuminen vähenee sisäkkäisessä PCR:ssä. Sisäkkäiset PCR-määritykset ovat hyödyllisiä herkkyyden ja/tai spesifisyyden lisäämiseksi. Sisäkkäinen PCR vaatii kuitenkin tietoa kiinnostuneesta sekvenssistä.
Mitä reaaliaikaiset PCR-määritykset ovat?
Reaaliaikainen PCR tai kvantitatiivinen PCR (Q PCR) on PCR:n muunneltu versio, joka mittaa PCR-tuotteet kvantitatiivisesti. Siksi tämä tekniikka kvantifioi vahvistuksen reaaliajassa käyttämällä reaaliaikaista PCR-konetta. Se on myös sopiva menetelmä näytteessä olevan kohdesekvenssin tai geenin määrän määrittämiseen.
Reaaliaikaisen PCR:n mielenkiintoinen ominaisuus on, että se yhdistää sekä amplifioinnin että todellisen kvantifioinnin yhdeksi vaiheeksi. Siksi geelielektroforeesin tarve havaitsemista varten voidaan eliminoida reaaliaikaisella PCR-tekniikalla. Fluoresoivien väriaineiden käyttö PCR-tuotteiden leimaamiseen PCR-reaktioiden aikana johtaa lopulta suoraan kvantifiointiin. Kun PCR-tuotteet kerätään, myös fluoresoivat signaalit kerääntyvät, ja reaaliaikainen kone mittaa ne. SYBR Green ja Taqman ovat kaksi tapaa havaita tai seurata reaaliaikaisen PCR:n vahvistusprosessia. Molemmat menetelmät seuraavat vahvistusprosessin edistymistä ja raportoivat tuotteen määrän reaaliajassa.
Kuva 03: Reaaliaikainen PCR
Reaaliaikaisella PCR:llä on laaja valikoima sovelluksia, kuten geeniekspression kvantifiointi, mikro-RNA:n ja ei-koodaavan RNA:n analyysi, SNP-genotyypitys, kopiolukuvarianttien havaitseminen, harvinaisten mutaatioiden havaitseminen, geneettisesti muunnettujen organismien havaitseminen ja tartunnanaiheuttajien havaitseminen.
Mitä yhtäläisyyksiä on perinteisten sisäkkäisten ja reaaliaikaisten PCR-määritysten välillä?
- Sisäkkäiset ja reaaliaikaiset PCR-määritykset ovat muunnelmia tavanomaisesta PCR-määrityksestä.
- Kaikki kolme tekniikkaa monistavat DNA-näytteitä.
- Heidän tuotteitaan voidaan käyttää sekvensointiin tai analysointiin.
- Nämä määritykset vaativat alukkeita.
Mitä eroa on perinteisillä sisäkkäisillä ja reaaliaikaisilla PCR-määrityksillä?
Perinteinen PCR on tekniikka, joka on kehitetty monistamaan tiettyjä DNA-sekvenssejä. Samaan aikaan Nested PCR on muunnelma tavanomaisesta PCR:stä, joka koostuu kahdesta peräkkäisestä monistusreaktiosta, ja reaaliaikainen PCR on muunnelma tavanomaisesta PCR:stä, joka pystyy kvantifioimaan monistetun tuotteen. Joten tämä on avainero tavanomaisten sisäkkäisten ja reaaliaikaisten PCR-määritysten välillä. Toisin kuin perinteinen ja reaaliaikainen PCR, sisäkkäinen PCR käyttää kahta alukesarjaa. Lisäksi sisäkkäisessä PCR:ssä on kaksi peräkkäistä monistusreaktiota epäspesifisen monistumisen vähentämiseksi. lisäksi perinteiset ja reaaliaikaiset PCR-määritykset eivät sisällä kahta peräkkäistä monistusreaktiota.
Seuraava infografiikka luettelee tavanomaisten sisäkkäisten ja reaaliaikaisten PCR-määritysten väliset erot taulukkomuodossa vierekkäin vertailua varten.
Yhteenveto – perinteiset vs. sisäkkäiset vs reaaliaikaiset PCR-määritykset
Perinteinen PCR on ensimmäinen tekniikka, joka on kehitetty monistamaan spesifisiä DNA-fragmentteja. Sisäkkäinen PCR ja reaaliaikainen PCR ovat kaksi muunnelmaa tavanomaisesta PCR:stä. Sisäkkäisessä PCR:ssä on kaksi peräkkäistä monistusreaktiota ja kahden alukesarjan käyttö. Reaaliaikainen PCR on kehitetty monistetun PCR-tuotteen kvantitoimiseksi. Siten tämä tiivistää eron tavanomaisten sisäkkäisten ja reaaliaikaisten PCR-määritysten välillä.
