Avainero – Probe vs Primer
Molekylaarinen koetin on pieni DNA- tai RNA-fragmentti, joka tunnistaa komplementaariset sekvenssit DNA:ssa tai RNA:ssa ja mahdollistaa kohdesekvenssin tunnistamisen. Aluke on pieni DNA- tai RNA-osa, joka toimii DNA-synteesin lähtökohtana. Alukkeet ja koettimet hybridisoituvat templaatti-DNA:n tai kohde-DNA:n komplementaaristen nukleotidien kanssa. Tärkein ero koettimen ja alukkeen välillä on kuitenkin se, että alukkeet ovat välttämättömiä DNA:n replikaatiolle, kun taas koettimet ovat välttämättömiä spesifisten sekvenssien havaitsemiseksi näyte-DNA:ssa.
Mikä on anturi?
Koetin on pieni DNA- tai RNA-fragmentti, jota käytetään kohde-DNA:n tai RNA:n havaitsemiseen näytteestä molekyylihybridisaatiolla. Ne tunnetaan myös molekyylimarkkereina. Koettimen pituus voi vaihdella (100 - 1000 emästä), ja koetinnukleotidit ovat komplementaarisia kohdesekvenssin osan kanssa. Havaitsemisen helpottamiseksi koettimet leimataan radioaktiivisilla isotoopeilla tai fluoresoivilla väriaineilla tai vasta-aineilla. Koettimet sitoutuvat kohdesekvenssin komplementaarisiin emäksiin ja paljastavat kohde-DNA:n tai -RNA:n läsnäolon näytteessä. Koettimien merkitsemiseen on kaksi päämenetelmää: päätemerkintä ja nimimerkkimuunnos. Koettimet luokitellaan eri tyyppeihin, mukaan lukien DNA-koettimet, RNA-koettimet, cDNa-koettimet ja synteettiset oligonukleotidikoettimet, ja ne valmistetaan eri tekniikoilla.
Luotaimet ovat tärkeitä työkaluja monilla mikrobi- ja molekyylialoilla, kuten virologiassa, oikeuslääketieteellisessä patologiassa, isyystestauksessa, DNA-sormenjälkien ottamisessa, geneettisten sairauksien havaitsemisessa, RFLP:ssä, molekyylisytogenetiikkassa, in situ -hybridisaatiossa jne.
Kuva 01: Fluoresoivasti leimattu koetin, jota käytetään FISHissa patogeenien havaitsemiseen
Mikä on pohjamaali?
Aluke on lyhyt DNA- tai RNA-fragmentti, joka toimii DNA-synteesin initiaattorina. DNA-polymeraasientsyymi lisää nukleotideja alukesekvenssin 3'-OH-ryhmään ja syntetisoi uuden juosteen, joka on komplementaarinen templaatti-DNA:lle. Alukkeet ovat hyvin lyhyitä fragmentteja, joiden pituus on 18-20 nukleotidia. Ne syntetisoidaan kemiallisesti laboratoriossa in vitro DNA-amplifikaatiota (PCR) varten. Alukkeilla voi olla mikä tahansa nukleotidisekvenssi, koska käyttäjä on suunnitellut ne. Ne syntetisoidaan sopimaan templaatti-DNA:n komplementaaristen emästen kanssa. Siksi sillä voi olla mikä tahansa nukleotidisekvenssi. Alukkeet ovat äärimmäisen tärkeitä DNA:n replikaatiolle, koska DNA-polymeraasi ei pysty syntetisoimaan uutta DNA:ta ilman olemassa olevaa DNA-palaa. Kun suunnittelet alukkeita PCR:ää varten, seuraavat asiat on otettava huomioon:
- Alukkeiden tulee sisältää komplementaariset nukleotidit sen DNA:n viereiseen päähän, joka haluaa monistua.
- Alusteiden sulamislämpötilan tulee olla välillä 55–65 0C
- G- ja C-sisällön tulee olla 50–60 %.
PCR:ssä käytetään kahta aluketta eteenpäin ja käänteisenä näyte-DNA:n molempien juosteiden replikoimiseksi. Alukkeita käytetään yleisesti PCR- ja DNA-sekvensointiin.
Kuva 02: Alukkeen pariutus PCR:ssä
Mitä eroa on Probella ja Primerilla?
Probe vs Primer |
|
| Koetin on pieni DNA/RNA-fragmentti, jota käytetään kohdesekvenssin läsnäolon havaitsemiseen näytteessä molekyylihybridisaatiolla. | Aluke on pieni DNA- tai RNA-osa, joka toimii DNA:n replikaation lähtökohtana. |
| Toiminto | |
| Tämä havaitsee tietyn sekvenssin esiintymisen DNA- tai RNA-näytteessä. | Tämä toimii DNA-synteesin lähtökohtana. |
| Pituus | |
| Pituus voi olla välillä 100–1000 emästä | Pituus on yleensä noin 18-20 emästä |
| Sidonta täydentävällä sekvenssillä | |
| Koetin hybridisoituu kohdesekvenssin komplementaaristen emästen kanssa | Aluke pariutuu DNA-säikeiden komplementaaristen emästen kanssa. |
| Etiketti | |
| Anturit on merkitty tunnistuksen helpottamiseksi | Alusteet eivät yleensä ole merkittyjä |
| Käytä PCR:ssä | |
| Koettimia ei käytetä PCR:ssä | PCR:ssä käytetään alukkeita |
Yhteenveto – Probe vs Primer
Koetin on pieni DNA- tai RNA-sekvenssin fragmentti, joka voidaan hybridisoida komplementaaristen nukleotidien kanssa kohdesekvenssin havaitsemiseksi näytteestä. Koettimet leimataan radioaktiivisesti, immunologisesti tai fluoresoivasti kohdesekvenssin läsnäolon näkemiseksi. Aluke on hyvin pieni DNA- tai RNA-fragmentti, joka toimii in vitro DNA-monistuksen lähtökohtana. DNA-polymeraasi tunnistaa 3'-OH-ryhmän alukkeen ja käynnistää uuden, templaatille komplementaarisen juosteen rakentamisen. Koettimet ja alukkeet toimivat samalla tavalla hybridisoitumalla komplementaaristen nukleotidien kanssa. Siten tärkein ero anturin ja alukkeen välillä on niiden päätoiminto.
