Avainero – lämmin vs kylmä trypsinointi
Lämmin ja kylmä trypsinisointi ovat kaksi menetelmää, joita käytetään solujen entsymaattisessa hajotuksessa eläinsoluviljelyssä. Avainero lämpimän ja kylmän trypsinisoinnin välillä, kuten nimet viittaavat, riippuu lämpötilasta, jossa trypsiini lisätään solujen hajoamista varten. Lämmin trypsinointi tapahtuu korkeammissa lämpötiloissa (36,5 – 37 0C), kun taas kylmä trypsinointi tapahtuu matalan lämpötilan olosuhteissa.
Eläinsolujen primäärisoluviljelyn aikana käytetään kolmea päämenetelmää, jotka ovat osoittautuneet onnistuneiksi. Kolme menetelmää sisältävät solujen mekaanisen hajoamisen, solujen entsymaattisen hajoamisen ja primaarisen eksplanttitekniikan. Solujen entsymaattinen hajoaminen johtaa solujen eristämiseen, ja sen suorittaa proteiineja hajottava entsyymi trypsiini. Siksi tämä prosessi tunnetaan nimellä trypsinisaatio. Trypsinointi voidaan tehdä kahdessa eri tilanteessa, nimittäin lämpimässä trypsinisaatiossa ja kylmässä trypsinisaatiossa. Lämmin trypsinointi on menetelmä, jossa soluja käsitellään trypsiinillä lämpimissä olosuhteissa 36,5-37 0C lämpötilassa. Kylmä trypsinointi on trypsiinikäsittelyprosessi, joka tapahtuu kylmissä olosuhteissa, mieluiten jäässä pitäen erittäin alhaisia lämpötiloja.
Mitä on lämmin trypsinointi?
Trypsinointi voidaan tehdä solukomponenttien hajottamiseksi solujen eristämiseksi primäärisen soluviljelmän tuottamiseksi. Trypsiini on proteiinia hajottava entsyymi, ja trypsinisoinnissa käytettävä entsyymiseos voi olla joko raakauute tai puhdistettu tuote. Raakauutteen sanotaan olevan tehokkaampi proteiinien hajoamisessa ja solujen hajoamisessa, koska se sisältää muita hajottavia entsyymejä.
Lämmin trypsinointi on yleisimmin käytetty entsymaattinen menetelmä korkeammissa lämpötiloissa tapahtuvaan solujen hajoamiseen. Ennen trypsinointikäsittelyä haluttu kudos pilkotaan pienemmiksi paloiksi. Se helpottaa helppoa erittelyprosessia. Hienonnettu kudos pestään sitten erityisessä väliaineessa, joka tunnetaan nimellä Dissection Basal S alt medium.
Pesuvaiheen päätyttyä solut muunnetaan pulloon, joka sisältää aktiivisen entsyymin, joka on trypsiini. Koska tämä tekniikka edellyttää lämmintä trypsinointiprotokollaa, trypsiini asetetaan noin 37 0C lämpötilaan noin neljäksi tunniksi.
Kuva 01: Trypsiini
Sisältö sekoitetaan ja sekoitetaan käyttämällä sentrifugointimenetelmiä protokollan helpottamiseksi ja hajoamisprosessin nopeuttamiseksi. Kun suositeltu aika on saavutettu, solut voidaan johtaa supernatantista. Supernatantista peräisin olevia soluja inkuboidaan sitten tietyssä lämpötilassa ja tietyssä ajassa.
Mikä on kylmätrypsinisointi?
Kylmä trypsinointi on toinen trypsinointityyppi, joka tapahtuu kylmissä olosuhteissa. Tässä tekniikassa hienonnetut ja pestyt solut laitetaan pulloihin jäälle ja liotetaan sitten trypsiinillä. Liotusaika on paljon pidempi – noin 6 – 24 tuntia.
Liotustoimenpiteen jälkeen trypsiini poistetaan solulysaatista ja kudospaloja inkuboidaan edelleen 37 0C lämpötilassa noin 20–30 minuuttia. Solujen hajoaminen saadaan aikaan pipetoimalla toistuvasti kudosseosta. Tämä sallii solujen irtautua kalvosta ja tulla supernatanttiin. Kun solut ovat supernatantissa, niitä inkuboidaan ja kasvatetaan halutussa lämpötilassa ja halutussa ajanjaksossa.
Kylmä trypsinointimenetelmällä on useita etuja
- Elävien solujen suurempi saanto, koska soluvauriot minimoidaan. Soluvauriot minimoidaan, kun sentrifugointivaiheita ei käytetä.
- Erittäin kätevä tapa.
- Vähemmän työläs.
Kylmä trypsinointimenetelmän päärajoitus on, että suuria määriä ei voida käyttää yhdessä tapauksessa.
Mitä yhtäläisyyksiä on lämpimän ja kylmän trypsinisoinnin välillä?
- Sekä lämpimässä että kylmässä trypsinointiprosessissa käytetään trypsiinientsyymiä solujen hajottamiseksi.
- Sekä lämmin- että kylmätrypsinisointiprosesseja käytetään soluviljelymenetelmissä solujen hajottamiseksi.
- Sekä lämpimässä että kylmässä trypsinisaatiokäsittelyssä solut ovat peräisin supernatantista.
Mitä eroa on lämpimällä ja kylmällä trypsinisoinnilla?
Lämmin vs kylmä trypsinointi |
|
| Lämmin trypsinointi on menetelmä, jolla soluja käsitellään trypsiinillä lämpimissä olosuhteissa 36,5–37 °C:n lämpötilassa 0. | Kylmätrypsinisointi on trypsiinikäsittelyprosessi, joka tapahtuu kylmissä olosuhteissa, mieluiten jäässä pitäen erittäin alhaisia lämpötiloja. |
| Protokolla | |
| Katkaistuja kudospaloja pidetään 37 0C:ssa jatkuvasti koko toimenpiteen ajan. | Huikaistut pehmopaperipalat pidetään aluksi jääkylmissä lämpötiloissa ja sitten 37 °C:ssa 0. |
| Lämpötila | |
| Lämmin trypsinointi tapahtuu 36,5 - 37 °C:ssa 0 | Kylmä trypsinointi tapahtuu jääkylmissä lämpötiloissa. |
| Aikaa kulunut | |
| Lämpimän trypsinoinnin koko prosessi vaatii vähemmän aikaa (noin 4 tuntia). | Pidempi aika (noin 6–24 tuntia) tarvitaan kylmätrypsinointiin. |
| Elävien solujen tuotto | |
| Vähän lämmin trypsinointi. | Korkea kylmä trypsinointi. |
| Sentrifugoinnin käyttö | |
| Sentrifugointi vaaditaan solujen hajottamiseksi lämpimässä trypsinisoinnissa. | Sentrifugointia ei vaadita kylmätrypsinisoinnissa. |
| Alkuperäinen kudosmäärä trypsinointia varten | |
| Lämmin trypsinisoinnissa voidaan käyttää suurempia määriä kudosta. | Pienempi määrä kudosta voidaan käyttää kylmätrypsinisoinnissa. |
| Soluvaurio | |
| Korkea johtuen sentrifugoinnista lämpimässä trypsinoinnissa. | Vähemmän kylmätrypsinisoinnin vuoksi. |
Yhteenveto – lämmin vs kylmä trypsinointi
Trypsinisointi on menetelmä, jossa käytetään proteiineja hajottavaa trypsiinientsyymiä primaaristen soluviljelmien hajottamiseen ja valmistukseen soluviljelyprosessin aikana. Trypsinisoinnissa on kaksi päätekniikkaa, jotka perustuvat toimenpiteen aikana käytettyihin lämpötiloihin. Ne ovat lämmin ja kylmä trypsinointi. Lämmin trypsinointi suoritetaan 37 0C:ssa, kun taas kylmä trypsinointi suoritetaan jääkylmissä olosuhteissa. Vaikka kylmä trypsinointi vie pidempään loppuun, sillä sanotaan olevan suurempi elinkelpoisten solujen saanto. Tämä johtuu siitä tosiasiasta, että soluvauriot ovat minimoituja kylmätrypsinisoinnissa, koska siinä ei käytetä voimakkaita sentrifugointivaiheita. Tämä on ero lämpimän ja kylmän trypsinisoinnin välillä.
