Avainero nick-translaatioiden ja päiden täytön välillä on se, että nick-translaatio on prosessi, joka luo leimattuja DNA-koettimia erilaisiin hybridisaatioreaktioihin, kun taas päiden täyttö on tekniikka, jolla luodaan tylppyjä fragmentteja lisäämällä nukleotideja yksijuosteisiin ulkonemiin.
Nick translaatio ja päiden täyttö ovat kaksi molekyylibiologiassa käytettyä tekniikkaa. Nickin translaatiota käytetään leimaamaan koettimet hybridisaatiota varten spesifisten nukleotidisekvenssien havaitsemiseksi. Päätytäytteellä valmistetaan tylppäisiä fragmentteja, joissa oli tahmeat päät ja yksisäikeiset ulkonemat. Molemmilla tekniikoilla on suuri merkitys, ja niitä suoritetaan rutiininomaisesti molekyylitutkimuslaboratorioissa.
Mikä on Nick Translation?
Nick-translaatio on tärkeä tekniikka, jota käytetään leimattujen koettimien valmistukseen erilaisiin molekyylibiologisiin tekniikoihin, kuten blottaukseen, in situ -hybridisaatioon, fluoresoivaan in situ -hybridisaatioon jne. Se on DNA-leimausmenetelmä in vitro. DNA-koettimia käytetään spesifisten DNA- tai RNA-sekvenssien tunnistamiseen. Leimatun koettimen avulla spesifiset fragmentit voidaan merkitä tai visualisoida monimutkaisesta nukleiinihapposeoksesta. Siksi leimattuja koettimia valmistetaan käyttämällä erilaisia tekniikoita. Nickin translaatio on yksi tällainen menetelmä, joka tuottaa leimattuja koettimia DNaasi 1- ja DNA-polymeraasi 1 -entsyymien avulla.
Kuva 01: Nickin käännös
Nickin translaatioprosessi alkaa DNaasi 1 -entsyymiaktiivisuudesta. DNaasi 1 lisää särmiä kaksijuosteisen DNA:n fosfaattirunkoon katkaisemalla fosfodiesterisidoksia nukleotidien välillä. Kun nick on luotu, nukleotidista muodostuu vapaa 3′ OH-ryhmä, ja DNA-polymeraasi 1 -entsyymi vaikuttaa siihen. DNA-polymeraasi 1:n 5′-3′ eksonukleaasiaktiivisuus poistaa nukleotidit lovesta DNA-juosteen 3′-suunnassa.
Samaan aikaan DNA-polymeraasi 1 -entsyymin polymeraasiaktiivisuus toimii ja lisää nukleotideja korvatakseen poistetut nukleotidit. Jos nukleotidit on leimattu, korvaaminen tapahtuu leimatuilla nukleotideilla, ja se merkitsee DNA:n tunnistamista varten. Lopuksi tätä äskettäin syntetisoitua leimattua DNA:ta voidaan käyttää koettimina erilaisissa hybridisaatioreaktioissa.
Mikä on lopun täyttö?
Päiden täyttö on tekniikka, jota käytetään molekyylibiologiassa tylppyjen fragmenttien tekemiseen. Restriktiohajotus tuottaa fragmentteja, joissa on ulkonemia. Nämä fragmentit eivät ehkä ole yhteensopivia ligatoimiseksi plasmidivektoreihin. Vektorit on usein tylsistetty, jotta yhteensopimattomat päät voidaan yhdistää. Siksi fragmentit, joissa on ulkonevia päitä, voidaan tylpistää lisäämällä nukleotidit komplementaariseen juosteeseen käyttämällä ulkonemaa templaattina polymerointiin. Tämä prosessi tunnetaan nimellä lopun täyttö.
DNA-polymeraasit, kuten DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti ja T4-DNA-polymeraasi, katalysoivat päiden täyttöä. Ne lisäävät nukleotideja täyttääkseen (5′ → 3′) ja pureskellakseen takaisin (3′ → 5′). Kun tahmeat päät on täytetty, ne tylstyvät ja ovat valmiita ligoitumaan vektoriin.
Lisäksi päiden täyttöä voidaan käyttää DNA-molekyylien leimaamiseen. Sitä voidaan kuitenkin käyttää vain leimaamaan DNA-molekyylejä, joissa on tahmea pää. Nikkikäännökseen verrattuna päiden täyttö on hellävaraisempi menetelmä, joka harvoin aiheuttaa DNA-katkoja.
Mitä yhtäläisyyksiä on Nick-käännöksen ja lopun täytön välillä?
- Sekä nimimerkin käännös että päiden täyttö ovat molekyylibiologisia tekniikoita.
- Niitä voidaan käyttää antureiden merkitsemiseen.
- Molemmat ovat in vitro
Mitä eroa on Nick-käännöksen ja lopun täytön välillä?
Nick translation on tekniikka, joka luo leimattuja koettimia hybridisaatiota varten. Sitä vastoin päiden täyttö on tekniikka, joka luo tylsiä fragmentteja ligaatiota varten vektoreihin. Joten tämä on avainero nimimerkin käännöksen ja lopun täytön välillä. Lisäksi Nickin translaatio edellyttää 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuuden käyttöä, kun taas päiden täyttäminen ei vaadi 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuutta.
Alla oleva infografiikka taulukoi tarkemmat erot nimimerkin käännöksen ja lopun täytön välillä.
Yhteenveto – Nick Translation vs End Filling
Nick-translaatio on menetelmä, joka sisällyttää radioaktiivisesti leimatut nukleotidit DNA:han. Se syntetisoi leimattuja koettimia DNaasi 1 - ja E. coli DNA -polymeraasi 1 -entsyymien aktiivisuuden perusteella. Päätyjen täyttö puolestaan on tekniikka, joka tuottaa tylsiä fragmentteja. Kun fragmenteilla on tahmeat päät (yksijuosteiset ulkonemat), on välttämätöntä tehdä niistä tylsät päät, jotta ne voivat ligatoitua vektoreihin. Päätäyttö lisää yhteensopivia nukleotideja ja muodostaa tylppoja päitä, jotta ne ovat yhteensopivia ligaatiota varten. Näin ollen tämä tiivistää eron nimimerkin käännöksen ja lopun täytön välillä.
