Avainero Klenowin ja T4-DNA-polymeraasin välillä on se, että Klenow-fragmentti on suuri E. colin DNA-polymeraasi 1:n fragmentti, kun taas T4-DNA-polymeraasi on bakteriofagin T4 DNA-polymeraasi 1.
DNA-polymeraasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat DNA:n muodostumista lisäämällä deoksiribonukleotideja olemassa olevan alukkeen 3'-OH-päähän. DNA-polymeraaseja on erilaisia. Useimmat molekyylibiologiassa käytetyt DNA-polymeraasit ovat prokaryoottisia DNA-polymeraaseja. Klenow-fragmentti ja T4-DNA-polymeraasi ovat kahden tyyppisiä DNA-polymeraaseja, joilla on prokaryoottinen alkuperä. Klenow-fragmentti on suuri fragmentti, joka syntyy E.coli DNA-polymeraasi 1 kahdeksi fragmentiksi bakteeriproteaasisubtilisiinilla. T4 DNA-polymeraasi on bakteriofagin T4 DNA-polymeraasi 1. Sekä Klenow- että T4-DNA-polymeraasilla on 5'→3'-polymeraasi- ja 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuutta. Molemmista puuttuu 5′→3′-eksonukleaasiaktiivisuutta, mikä tekee niistä sopivampia moniin molekyylibiologian sovelluksiin.
Mikä Klenow on?
Klenow-fragmentti on DNA-polymeraasi, joka on hyödyllinen molekyylibiologiassa. Kun E. colin DNA-polymeraasi 1 pilkkoutuu proteolyyttisesti bakteeriproteaasin, subtilisiinin, vaikutuksesta, tuloksena on kaksi fragmenttia: toinen on suuri fragmentti ja toinen pieni fragmentti. Klenow-fragmentti on suuri fragmentti, joka on kooltaan 68 kDa. Klenow-fragmentilla on DNA Pol I:n 5'→3'-polymeraasi- ja 3'→5'-eksonukleaasi (oikoluku) -aktiivisuus. Klenow-fragmentin 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuus helpottaa väärin lisättyjen emästen poistamista polymeroinnin edetessä. Klenow-fragmentti ei sisällä 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuutta, mikä näkyy täysimittaisella tai ehjällä E.coli DNA-polymeraasi 1. On edullista, kun tarvitaan vain polymerointiaktiivisuutta. Klenow-fragmentteja käytetään täyttämään 5' ulokkeet, koettimien synteesiä, sekvensointia DNA:ta, kaksijuosteisen DNA:n synteesiä, cDNA:n toisen juosteen synteesiä ja kohdennettua mutageneesiä.
Kuva 01: Klenow-fragmentti
Tietyissä sovelluksissa Klenowin fragmentin 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuus tulee myös ei-toivotuksi. Se voidaan poistaa tuomalla mutaatio Klenowin fragmenttia koodaavaan geeniin. Tuloksena oleva Klenow-fragmentti tunnetaan ekso-Klenow-fragmenttina. Siksi ekso-Klenow-fragmentilla on vain E. coli -polymeraasi 1:n 5'→3'-polymeraasiaktiivisuus.
Mikä on T4 DNA -polymeraasi?
T4 DNA-polymeraasi on DNA-polymeraasi, joka katalysoi DNA:n synteesiä. Se on Bacteriophage T4:n koodaama proteiini. Rakenteellisesti T4-DNA-polymeraasi on 898 aminohappojäännösproteiini (molekyylipaino 103,6 kDa). Se vaatii mallin ja alukkeen katalysoimaan synteesiä.
Kuva 02: T4 DNA-polymeraasi
Klenowin fragmentin tapaan T4-DNA-polymeraasilla on sekä 5′→3′-polymeraasi- että 3′→5′-eksonukleaasiaktiivisuutta. Lisäksi siltä puuttuu myös 5′→3′-eksonukleaasiaktiivisuus. T4-DNA-polymeraasi on käyttökelpoinen DNA-fragmenttien 5'-ulkoisten päiden täyttämisessä. Sitä käytetään usein myös kaksijuosteisen DNA:n 5'- tai 3'-pään leimaamiseen. T4-DNA-polymeraasia käytetään usein tylppä kloonauksessa. T4-DNA-polymeraasin 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuus (oikoluku) on voimakkaampi (yli 200 kertaa) kuin Klenowin fragmentin. Mikä tärkeintä, T4 DNA-polymeraasilla on korkea prosessiokyky (400 nukleotidia sekunnissa).
Mitä yhtäläisyyksiä Klenowin ja T4-DNA-polymeraasin välillä on?
- Klenow ja T4 DNA-polymeraasi ovat kaksi prokaryoottista polymeraasia.
- Molemmilla polymeraaseilla on 5′→3′-polymeraasi- ja 3′→5′-eksonukleaasiaktiivisuutta.
- Ne eivät osoita 5′→3′-eksonukleaasiaktiivisuutta.
- Molemmat entsyymit vaativat templaatin ja alukkeen DNA:n synteesin katalysoimiseksi.
- Nämä entsyymit voidaan lämpöinaktivoida 75 °C:ssa 0
Mitä eroa Klenowin ja T4 DNA-polymeraasin välillä on?
Avainero Klenowin ja T4-DNA-polymeraasin välillä on kunkin entsyymin alkuperä. Klenow-fragmentti on peräisin bakteerista, kun taas T4-DNA-polymeraasi on peräisin bakteriofagista, joka on virus. T4 DNA-polymeraasilla on korkea prosessiokyky kuin Klenowin fragmentilla. Lisäksi T4 DNA-polymeraasilla on voimakas oikolukuaktiivisuus kuin Klenowin fragmentilla. Tämä on siis toinen ero Klenowin ja T4 DNA-polymeraasin välillä.
Alla olevassa infografiikassa luetellaan lisää eroja Klenowin ja T4 DNA-polymeraasin välillä taulukkomuodossa.
Yhteenveto – Klenow vs T4 DNA Polymerase
Klenow-fragmentti on suuri fragmentti E. colin DNA-polymeraasi 1:stä. Sillä on vain 5'→3'-polymeraasi- ja 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuutta. Siitä puuttuu ehjän E. coli DNA pol 1:n 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuus. Siksi Klenow-fragmentti on bakteeripolymeraasi. Toisa alta T4-DNA-polymeraasi on T4-bakteriofagin koodaama polymeraasi. Samoin kuin Klenow-fragmentti, se sisältää sekä 5'→3'-polymeraasi- että 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuutta, ja siitä puuttuu 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuutta. T4 DNA-polymeraasilla on kuitenkin korkea prosessiokyky ja korkea oikolukuaktiivisuus kuin Klenowin fragmentilla. Joten tämä on avainero Klenowin ja T4 DNA-polymeraasin välillä.
