Avainero Golden Gaten ja Gibson Assemblyn välillä on, että Golden Gate luottaa restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä, kun taas Gibson Assembly ei luota restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä sekvenssissä. olla kloonattu.
Viime vuosikymmeninä molekyylitutkijat ovat kehittäneet erilaisia standardoituja menetelmiä, jotka mahdollistavat useiden DNA-fragmenttien helpomman kokoamisen yhdeksi osaksi. Siksi tutkijat käyttävät laajasti tieteellisissä kokeissa kloonausmenetelmiä, kuten restriktioentsyymiligaatiota, gateway-kloonusta, Gibson Assemblyä, Golden Gate Assemblyä ja TOPO-kloonusta. Siksi Golden Gate ja Gibson Assembly ovat kaksi molekyylikloonausmenetelmää, jotka mahdollistavat useiden DNA-fragmenttien kokoamisen yhdeksi osaksi.
Mikä on Golden Gate Assembly?
Golden Gate on molekyylikloonausmenetelmä, joka helpottaa useiden DNA-fragmenttien kokoamista yhdeksi kappaleeksi. Tämä menetelmä perustuu restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä. Se sai alkunsa vuonna 1996. Tämä tekniikka käyttää tyypin IIS restriktioentsyymejä ja T4 DNA-ligaasia. Nämä entsyymit leikkaavat DNA:ta tunnistuskohtien ulkopuolella. Ne voivat luoda ei-palindromisia ulkonemia. Siksi useita DNA-fragmentteja voidaan koota käyttämällä ulkonevien sekvenssien yhdistelmiä.
Kuva 01: Kultainen portti
Golden Gate -kokoonpanomenettely
Golden Gate -tekniikassa on kolme päävaihetta:
- ylitysten luominen kloonausvektoriin,
- useiden DNA-inserttien kokoaminen käyttämällä fragmenttikohtaisia sekvenssejä ulokkeissa, ja
- ligaatio.
Golden Gate -kokoonpano käyttää pyöreitä kloonausvektoreita (kohdevektori). Lisäksi tässä menetelmässä restriktiokohta eliminoidaan ligoidusta tuotteesta, jotta pilkkominen ja ligaatio voidaan suorittaa samanaikaisesti. Tyypillinen Golden Gaten lämpösykliprotokolla värähtelee välillä 37 °C ja 16 °C, koska 37 °C on optimaalinen restriktioentsyymeille ja 16 °C on optimaalinen ligaaseille.
Mikä on Gibson Assembly?
Gibson Assembly on molekyylikloonausmenetelmä, joka mahdollistaa useiden DNA-fragmenttien kokoamisen yhdeksi osaksi. Toisin kuin Golden Gate -menetelmä, tämä menetelmä ei ole riippuvainen restriktiokohtien läsnäolosta tietyssä kloonattavassa sekvenssissä. Sen löysi Daniel G. Gibson J. Craig Venter -instituutista. Tämä tekniikka on eräänlainen sekvenssistä ja ligaasista riippumaton kloonausmenetelmä (SLIC).
Kuva 02: Gibson Assembly
Gibsonin kokoonpanomenettely
Gibson Assembly tarvitsee DNA-fragmentteja, jotka sisältävät 20-40 emäsparia limittäin viereisten DNA-fragmenttien kanssa. Päällekkäisyydet lisätään PCR:n avulla. Sitten nämä DNA-fragmentit lisätään Gibson-maser-seokseen, jossa on kolme entsyymiä. Tämä menettely suoritetaan isotermisissä olosuhteissa (50 °C 1 tunnin ajan) käyttämällä kolmea eri entsyymiä: eksonukleaasia, DNA-polymeraasia ja DNA-ligaasia. Eksonukleaasi pureskelee DNA:n takaisin 5' päästä. Siten se ei estä polymeraasiaktiivisuutta ja salli reaktion edetä yhdessä prosessissa. Saadut vierekkäisten DNA-fragmenttien yksijuosteiset alueet voidaan pariuttaa päällekkäisten sekvenssien vuoksi. DNA-polymeraasi täyttää aukot lisäämällä nukleotideja. Lopuksi DNA-ligaasi liittyy kovalenttisesti viereisten segmenttien DNA:han. Normaalisti Gibson Assembly käyttää linearisoituja kohdevektoreita. Lisäksi tällä menetelmällä voidaan samanaikaisesti yhdistää jopa 15 DNA-fragmenttia sekvenssin samank altaisuuden perusteella.
Golden Gaten ja Gibson Assemblyn yhtäläisyydet
- Golden Gate ja Gibson Assembly ovat kaksi molekyylikloonausmenetelmää.
- Molemmat menetelmät voivat koota useita DNA-fragmentteja yhdeksi kappaleeksi.
- Nämä menetelmät käyttävät kohdevektoreita.
- Molemmat menetelmät käyttävät lämpösyklilaitteita useiden DNA-fragmenttien kokoamiseen.
- Niitä käytetään kohdennetussa mutageneesissä.
Golden Gaten ja Gibson Assemblyn ero
Golden Gate on molekyylikloonausmenetelmä, jota käytetään useiden DNA-fragmenttien kokoamiseen yhdeksi kappaleeksi ja joka perustuu restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä, kun taas Gibson Assembly on molekyylikloonausmenetelmä, jota käytetään useiden DNA-fragmenttien kokoaminen yhdeksi kappaleeksi luottamatta restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä. Tämä on avainero Golden Gaten ja Gibson Assemblyn välillä. Lisäksi Golden Gate -menetelmä käyttää pyöreää kohdevektoria, kun taas Gibson Assembly -menetelmä käyttää linearisoitua kohdevektoria.
Seuraava infografiikka taulukoi Golden Gaten ja Gibson Assemblyn välisen eron.
Yhteenveto – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekylaarinen kloonaus on menetelmä, jolla kootaan yhdistelmä-DNA-molekyylejä ja ohjataan niiden replikaatiota isäntäorganismeissa. Golden Gate ja Gibson Assembly ovat kaksi molekyylikloonausmenetelmää, jotka mahdollistavat useiden DNA-fragmenttien kokoamisen yhdeksi kappaleeksi. Golden Gate -menetelmä perustuu restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä, kun taas Gibson Assembly ei luota restriktiokohtien läsnäoloon tietyssä kloonattavassa sekvenssissä. Näin ollen tämä on avainero Golden Gaten ja Gibson Assemblyn välillä.
