Avainero – Microarray vs RNA-sekvensointi
Transkriptomi edustaa solussa olevan RNA:n koko sisältöä, mukaan lukien mRNA, rRNA, tRNA, hajotettu RNA ja hajoamaton RNA. Transkriptomin profilointi on tärkeä prosessi solun oivallusten ymmärtämiseksi. Transkription profilointiin on olemassa useita kehittyneitä menetelmiä. Mikrosiru- ja RNA-sekvensointi ovat kahden tyyppisiä tekniikoita, jotka on kehitetty transkription analysointiin. avainero mikrosiru- ja RNA-sekvensoinnin välillä on se, että mikrosiru perustuu enn alta suunniteltujen leimattujen koettimien hybridisaatiopotentiaaliin kohde-cDNA-sekvensseillä, kun taas RNA-sekvensointi perustuu cDNA-säikeiden suoraan sekvensointiin kehittyneillä sekvensointitekniikoilla, kuten NGS. Microarray suoritetaan ennakkotiedolla sekvensseistä ja RNA-sekvensointi suoritetaan ilman ennakkotietoa sekvensseistä.
Mikä on Microarray?
Microarray on vankka, luotettava ja tehokas menetelmä, jota tutkijat käyttävät transkription profilointiin. Se on suosituin tapa transkriptioanalyysiin. Se on edullinen menetelmä, joka riippuu hybridisaatiokoettimista.
Tekniikka alkaa mRNA:n uuttamisella näytteestä ja cDNA-kirjaston rakentamisesta kokonais-RNA:sta. Sitten se sekoitetaan fluoresoivasti leimattujen enn alta suunniteltujen koettimien kanssa kiinteällä pinnalla (pistematriisi). Komplementaariset sekvenssit hybridisoituvat mikrosirun leimattujen koettimien kanssa. Sitten mikrosiru pestään ja seulotaan, ja kuva kvantifioidaan. Kerätyt tiedot tulee analysoida suhteellisten ilmaisuprofiilien saamiseksi.
Mikroarray-koettimien intensiteetin oletetaan olevan verrannollinen näytteen transkriptien määrään. Tekniikan tarkkuus riippuu kuitenkin suunnitelluista koettimista, sekvenssin ennakkotiedosta ja koettimien affiniteetista hybridisaatioon. Siksi microarray-tekniikalla on rajoituksia. Microarray-tekniikkaa ei voida suorittaa alhaisen runsauden transkripteilla. Se ei pysty erottamaan isoformeja ja tunnistamaan geneettisiä variantteja. Koska tämä menetelmä riippuu koettimien hybridisaatiosta, microarray-tekniikassa esiintyy joitakin hybridisaatioon liittyviä ongelmia, kuten ristihybridisaatio, epäspesifinen hybridisaatio jne.
Kuva 01: Microarray
Mitä RNA-sekvensointi on?
RNA-haulikkosekvensointi (RNA-seq) on äskettäin kehitetty koko transkription sekvensointitekniikka. Se on nopea ja tehokas menetelmä transkription profilointiin. Se kvantifioi suoraan geenien ilmentymisen ja johtaa transkriptomin syvälliseen tutkimukseen. RNA-sekvenssi ei riipu enn alta suunnitelluista koettimista tai aiemmasta tiedosta sekvensseistä. Siksi RNA-seq-menetelmällä on korkea herkkyys ja kyky havaita uusia geenejä ja geneettisiä variantteja.
RNA-sekvensointimenetelmä suoritetaan useiden vaiheiden kautta. Solun kokonais-RNA on eristettävä ja fragmentoitava. Sitten käänteistranskriptaasia käyttäen on valmistettava cDNA-kirjasto. Jokainen cDNA-juoste on liitettävä sovittimiin. Sitten ligatoidut fragmentit on monistettava ja puhdistettava. Lopuksi cDNA:n sekvensointi on suoritettava käyttämällä NGS-menetelmää.
Kuva 02: RNA-sekvensointi
Mitä eroa on Microarray- ja RNA-sekvensoinnilla?
Microarray vs RNA-sekvensointi |
|
| Microarray on vankka, luotettava ja tehokas menetelmä. | RNA-sekvensointi on tarkka ja tehokas menetelmä. |
| Kustannus | |
| Tämä on edullinen menetelmä. | Tämä on kallis menetelmä. |
| Suuren näytemäärän analyysi | |
| Tämä helpottaa useiden näytteiden analysointia samanaikaisesti. | Tämä helpottaa useiden näytteiden analysointia. |
| Dataanalyysi | |
| Tietojen analysointi on monimutkaista. | Tällä menetelmällä luodaan lisää tietoa; siksi prosessi on monimutkaisempi. |
| Aiempi tuntemus jaksoista | |
| Tämä menetelmä perustuu hybridisaatiokoettimiin, joten edellytetään aiempaa tietoa sekvensseistä. | Tämä menetelmä ei riipu aiemmasta järjestystiedosta. |
| Rakenteelliset muunnelmat ja uudet geenit | |
| Tämä menetelmä ei pysty havaitsemaan rakenteellisia muunnelmia ja uusia geenejä. | Tällä menetelmällä voidaan havaita rakenteellisia muunnelmia, kuten geenien fuusioitumista, vaihtoehtoista silmukointia ja uusia geenejä. |
| Herkkyys | |
| Tämä ei pysty havaitsemaan eroja isoformien ilmentymisessä, joten sen herkkyys on rajallinen. | Tällä on korkea herkkyys. |
| Tulos | |
| Tämä voi johtaa vain suhteellisiin lauseketasoihin. Tämä ei anna absoluuttista kvantifiointia geeniekspressiosta. | Se antaa absoluuttiset ja suhteelliset lauseketasot. |
| Datan uudelleenanalyysi | |
| Tämä on suoritettava uudelleen, jotta se voidaan analysoida uudelleen. | Sekvensointitiedot voidaan analysoida uudelleen. |
| Tarve erityisille henkilöille ja infrastruktuurille | |
| Mikromatriisi ei vaadi erityistä infrastruktuuria ja henkilökuntaa. | RNA-sekvensoinnin edellyttämä infrastruktuuri ja henkilöstö. |
| Tekniset ongelmat | |
| Microarray-tekniikassa on teknisiä ongelmia, kuten ristihybridisaatio, epäspesifinen hybridisaatio, yksittäisten koettimien rajoitettu havaitsemisnopeus jne. | RNA-seq-tekniikalla vältetään tekniset ongelmat, kuten ristihybridisaatio, epäspesifinen hybridisaatio, yksittäisten koettimien rajoitettu havaitsemisnopeus jne. |
| Biases | |
| Tämä on puolueellinen menetelmä, koska se riippuu hybridisaatiosta. | Bias on pieni verrattuna microarray-järjestelmään. |
Yhteenveto – Microarray vs RNA-sekvensointi
Microarray- ja RNA-sekvensointimenetelmät ovat korkean suorituskyvyn alustoja, jotka on kehitetty transkription profilointiin. Molemmat menetelmät tuottavat tuloksia, jotka korreloivat voimakkaasti geeniekspressioprofiilien kanssa. RNA-sekvensoinnilla on kuitenkin etuja mikrosiruun verrattuna geeniekspressioanalyysissä. RNA-sekvensointi on mikrosirua herkempi menetelmä alhaisen runsauden transkriptien havaitsemiseksi. RNA-sekvensointi mahdollistaa myös isoformien erottamisen ja geenivarianttien tunnistamisen. Mikrosiru on kuitenkin useimpien tutkijoiden yhteinen valinta, koska RNA-sekvensointi on uusi ja kallis tekniikka, joka sisältää haasteita tietojen tallentamiseen ja monimutkaiseen data-analyysiin.
