Avainero kromatofokusoinnin ja isoelektrisen fokusoinnin välillä on se, että kromatofokusointi on eräänlainen pylväskromatografiamenetelmä, jossa käytetään ioninvaihtohartseja, kun taas isoelektrinen fokusointi on eräänlainen elektroforeesitekniikka, jossa käytetään immobilisoituja pH-gradienttigeelejä.
Kromatofokusointi ja isoelektrinen fokusointi ovat kaksi tekniikkaa, jotka erottavat proteiinit niiden isoelektristen pisteiden mukaan. Sekä kromatofokusoinnilla että isoelektrisellä tarkennuksella on suuri erotuskyky. Kromatofokusointi on korkearesoluutioinen pylväskromatografiamenetelmä, kun taas isoelektrinen fokusointi on elektroforeettinen erotusmenetelmä. Lisäksi kromatofokusointi ei käytä sähkökenttää, kun taas isoelektrinen tarkennus vaatii sähkökentän.
Mitä on kromatofokusointi?
Kromatofokusointi on korkean eluutiokromatografian tyyppi, joka erottaa proteiinit niiden isoelektrisen pisteen erojen mukaan. Se käyttää ioninvaihtohartsikolonnia ja sisäisesti kehitettyä pH-gradienttia. Toisin kuin isoelektrinen tarkennus, kromatofokusointi ei sisällä sähkökenttää. Kromatofokusointi on tehokas puhdistustekniikka, jolla voidaan erottaa hyvin samank altaisia molekyylejä, vaikka ne eroavatkin vain 0,02 pH-yksiköllä. Siksi kromatofokusointi sopii parhaiten lopulliseksi kiillotusvaiheeksi, kun tarvitaan suurta resoluutiota hyvin samank altaisten komponenttien erottamisessa.
Kromatofokusoinnissa näyte levitetään kolonniin sekoittamalla se aloituspuskurin kanssa. Proteiinit, joiden pH on isoelektrisen pisteensä yläpuolella, ovat negatiivisesti varautuneita ja ne pysyvät lähellä kolonnin yläosaa, kun taas muut proteiinit, joiden pH on isoelektrisen pisteensä alapuolella, kulkeutuvat alas kolonnia. Proteiini, jolla on korkein isoelektrinen piste, eluoituu ensin, kun taas proteiini, jonka isoelektrinen piste on alhaisin, eluoituu viimeisenä kolonnista. Tähän tekniikkaan vaikuttavat useat tekijät, kuten proteiinin saostuminen ja pH-gradientin lineaarisuus.
Mitä isosähköinen tarkennus on?
Isoelektrinen fokusointi on tekniikka, joka erottaa eri molekyylit niiden isoelektrisen pisteen perusteella. Se tunnetaan myös nimellä sähkötarkennus. Tätä tekniikkaa käytetään usein proteiinien erottamiseen geelissä. Isoelektrisessä fokusoinnissa näyte lisätään immobilisoituihin pH-gradienttigeeleihin (IPG). IPG-geeli on akryyliamidigeelimatriisi, joka on kopolymeroitu pH-gradientilla. Proteiinit kulkevat kohti katodia, kunnes löytävät isoelektristen pisteidensä pH-alueen. Kun proteiini saavuttaa pH-arvon, jossa ei ole nettovarausta, kulkeutuminen lakkaa ja muodostaa paikallaan pysyvän vyöhykkeen. Samoin jokainen proteiini antaa vyöhykkeen pH-gradientin kohdassa, joka vastaa sen isoelektristä pistettä.
Kuva 01: Isoelektrinen tarkennus
Isoelektrinen tarkennus on kaksiulotteisen geelielektroforeesin ensimmäinen vaihe. Tässä tekniikassa proteiinit erotetaan ensin isoelektristen pisteidensä mukaan isoelektrisellä fokusoinnilla ja sitten erotetaan niiden molekyylipainon perusteella SDS-PAGE:lla.
Mitä yhtäläisyyksiä kromatofokusoinnin ja isoelektrisen tarkennuksen välillä on?
- Kromatofokusointi ja isoelektrinen tarkennus ovat kaksi erittäin erottelevaa menetelmää.
- Molemmat perustuvat proteiinien isoelektriseen pisteeseen.
- Näissä tekniikoissa käytetään pH-gradienttia.
- Molemmat menetelmät ovat informatiivisia ihmisen hemoglobiinivarianttien karakterisoinnissa.
- Ne voivat erottaa molekyylejä, joissa pI-arvot eroavat vain 0,02 pH-yksikköä.
Mitä eroa on kromatofokusoinnilla ja isoelektrisellä tarkennuksella?
Cromatofocusing on korkearesoluutioinen pylväskromatografiatekniikka, joka erottaa proteiinit niiden isoelektrisen pisteen mukaan. Sitä vastoin isoelektrinen fokusointi on elektroforeettinen tekniikka, joka erottaa proteiinit niiden isoelektrisen pisteen mukaan käyttämällä sähkökenttää pitkin kapillaariin muodostunutta pH-gradienttia. Tämä on siis tärkein ero kromatofokusoinnin ja isoelektrisen tarkennuksen välillä.
Toinen ero kromatofokusoinnin ja isoelektrisen tarkennuksen välillä on se, että kromatofokusointi ei sisällä sähkökenttää, kun taas isoelektrinen tarkennus vaatii sähkökentän.
Yhteenveto – kromatofokusointi vs isosähköinen tarkennus
Kromatofokusointi ja isoelektrinen fokusointi ovat kaksi samanlaista tekniikkaa, joilla on korkea molekyylien, erityisesti hyvin samank altaisten molekyylien, erotuskyky. Kromatofokusointi on korkearesoluutioinen pylväskromatografiatekniikka, kun taas isoelektrinen fokusointi on elektroforeesimenetelmä. Kromatofokusointi ei sisällä sähkökenttää, toisin kuin isoelektrinen tarkennus. Siten tämä tiivistää eron kromatofokusoinnin ja isoelektrisen tarkennuksen välillä.
