Avainero – paperi vs ohut kerros vs pylväskromatografia
Paperikromatografia, ohutkerroskromatografia ja pylväskromatografia ovat kolmenlaisia kromatografisia tekniikoita. Keskeinen ero paperikromatografian, ohutkerroskromatografian ja pylväskromatografian välillä perustuu kromatografiatekniikassa käytetyn stationaarifaasin tyyppiin. Paperikromatografiassa käytetään kiinteänä faasina selluloosapaperia, ohutkerroskromatografiassa alumiinioksidia tai silikageeliä stationaarifaasina, kun taas pylväskromatografiassa pylväs, joka on pakattu sopivalla matriisimateriaalilla, stationaarifaasina.
Biomolekyylien, kuten proteiinien ja hiilihydraattien, erottelu- ja tunnistamisprosessissa kromatografia on tärkeä käytetty biofyysinen tekniikka. Kromatografia erottaa yhdisteet niiden liukoisuuden, koon ja varauksen perusteella. Erotusmekanismiin perustuen kromatografiassa käytetään mekanismeja, kuten ioninvaihtoa, absorptiota, partitiota ja kokoekskluusiota, ja kromatografisia tekniikoita on kolme; nimittäin paperi-, ohutkerros- ja pylväskromatografia. Paperikromatografia perustuu yhdisteen kiinteä-neste-adsorptioon ja liukoisuuteen, ja siinä käytetään kiinteänä faasina selluloosapaperia. Ohutkerroskromatografia perustuu molekyylien kiinteä-neste-adsorptioon. Siinä on kiinteä faasi, joka on tyypillisesti valmistettu alumiinioksidista tai silikageelistä, ja liikkuva faasi, joka on liuotin. Pylväskromatografiassa käytetään matriisia, jota käytetään molekyylien erottamiseen pääasiassa niiden koon, affiniteetin tai varauksen perusteella.
Mitä paperikromatografia on?
Paperikromatografia on yksinkertaisin käytetty kromatografia, eikä sitä käytetä laajaan tutkimukseen. Sitä käytetään pääasiassa opiskelijalaboratorioissa biomolekyylien, kuten seoksissa olevien aminohappojen ja hiilihydraattien, tunnistamiseen. Paperikromatografiassa käytetään kiinteää faasia, joka valmistetaan käyttämällä selluloosapaperia tai Whatman-suodatinpaperia, ja liikkuvaa faasia, joka valmistetaan tavallisesti käyttämällä orgaanisia liuottimia, kuten n-butanolia jne. Stationaarifaasi kyllästetään vedellä, jolloin kiinteä faasi on nestemäistä. Siten, kun yhdisteet täplätään ja niiden annetaan kulkea liikkuvan faasin läsnä ollessa, yhdisteiden liukoisuudesta riippuen ne erotetaan. Siten kromatogrammia kehitettäessä voidaan tehdä värjäys kunkin yhdisteen ajon pituuden määrittämiseksi. Säilytyskerroin voidaan siten laskea.
Kuva 01: Paperikromatografia
Paperikromatografia voidaan edelleen luokitella nousevaan paperikromatografiaan ja laskevaan paperikromatografiaan riippuen juoksevan liuottimen suunnasta.
Mikä on ohutkerroskromatografia?
Ohutkerroskromatografia eli TLC on yleisesti käytetty tekniikka seoksen erilaisten aminohappojen tunnistamiseen tai proteiinien tunnistamiseen. Erotustekniikka perustuu kiinteä-neste-adsorptioon. Ohutkerroskromatografian aikana kiinteänä faasina käytetään alumiinioksidista tai silikageelistä valmistettua levyä. Liuotinseos vaihtelee tarpeen mukaan ja voi käyttää erilaisia orgaanisten yhdisteiden, kuten n-butanolin, etikkahapon ja veden yhdistelmiä liuottimen valmistamiseksi. Erotettavat yhdisteet laitetaan levylle ja upotetaan liuotinseokseen. Kun liuotin kulkee ylöspäin levyn antaman kapillaarivaikutuksen perusteella, myös levylle täplät yhdisteet liikkuvat riippuen niiden liukoisuudesta liuottimeen.
Kuva 02: Ohutkerroskromatografia
Täkkujen havaitseminen kromatogrammin ajon jälkeen tehdään erilaisilla värjäysmenetelmillä. Jotkut käyttävät ninhydriinivärjäystä, joka on melko myrkyllinen värjäysmenetelmä. Nykyaikaiset ohutkerroskromatogrammit käyttävät fluoresenssitekniikoita kromatogrammin katsomiseen ajon jälkeen. Kunkin yhdisteen retentioaika voidaan laskea kuljetun etäisyyden mukaan. Tätä voidaan käyttää erotetun yhdisteen tyypin tunnistamiseen käytetyn seoksen perusteella. TLC:tä käytetään pääasiassa aminohappojen tunnistamiseen proteiiniseoksesta ja myös seoksen erityyppisten monosakkaridien erottamiseen.
Mikä on pylväskromatografia?
Pylväskromatografia on laaja termi, jota käytetään kuvaamaan monenlaisia kromatografiatekniikoita, joissa käytetään pylväspohjaista erotusmenetelmää. Pylväskromatografiassa yhdisteiden erottamiseen käytetään fysikaalista pylvästä pakkausmateriaalin kanssa. Erotus voi perustua yhdisteiden erilaisiin fysikaalisiin ominaisuuksiin. Näitä ominaisuuksia voivat olla varaus, koko, 3D-rakenne ja sitoutumiskyky jne. Näin ollen matriisimateriaalilla pakattu kolonni toimii stationaarifaasina ja kolonniin lisätty pesupuskuri toimii liikkuvana faasina.
Jos molekyylit erotetaan koon perusteella, pakkausmateriaali pakataan siten, että se jättää huokoset, joiden läpi yhdisteet voivat kulkea. Näin ollen suuremmat molekyylit, jotka eivät voi virrata huokosten läpi, eluoituvat ensin, kun taas pienemmät molekyylit vievät paljon kauemmin eluoituakseen.
Kuva 03: Pylväskromatografia
Jos molekyylit erotetaan niiden varauksen perusteella, paikallaan oleva faasi sisältää joko anionin tai kationinvaihtajan, johon yhdisteet vedetään varauksensa perusteella. Siten pesuvaiheen aikana sitoutumattomat yhdisteet eluoituvat. Eluointipuskuria lisättäessä sitoutuneet varautuneet yhdisteet eluoituvat. Näiden eluenttien havaitseminen perustuu enimmäkseen spektrofotometrisiin tekniikoihin.
Mitä yhtäläisyyksiä paperiohutkerroksen ja pylväskromatografian välillä on?
- Koko paperin ohutkerros- ja pylväskromatografiaa käytetään kolmea tekniikkaa biomolekyylien, kuten aminohappojen, proteiinien ja hiilihydraattien, erottamiseen.
- Paperiohutkerros- ja pylväskromatografiatekniikoissa on liikkuva vaihe ja kiinteä vaihe.
- Paperiohutkerros- ja pylväskromatografiatekniikat käyttävät biofysikaalisia erottelumekanismeja.
Mitä eroa on paperiohutkerros- ja pylväskromatografialla?
Paperi vs ohut kerros vs pylväskromatografia |
|
| Paperikromatografia | Paperikromatografia on kromatografinen tekniikka, jota käytetään yhdisteiden erottamiseen neste-neste-adsorption ja yhdisteen liukoisuuden perusteella. Se käyttää selluloosapaperia kiinteänä faasinaan. |
| Ohutkerroskromatografia | Ohutkerroskromatografia on toinen kromatografinen tekniikka, joka perustuu molekyylien kiinteä-neste-adsorptioon. Siinä on kiinteä faasi, joka on valmistettu alumiinioksidista tai silikageelistä, ja liikkuvana faasina on liuotin, joka on liuotin. |
| Pylväskromatografia | Pylväskromatografiassa käytetään matriisia, jota käytetään molekyylien erottamiseen pääasiassa niiden koon, affiniteetin tai varauksen perusteella. |
| Stationary Phase | |
| Paperikromatografia | Whatmanin nitroselluloosasta valmistettua paperia käytetään stationaarifaasina paperikromatografiassa. |
| Ohutkerroskromatografia | Alumiinioksidia tai silikageeliä käytetään ohutkerroskromatografian stationaarifaasina. |
| Pylväskromatografia | Pylväskromatografiassa käytetään kiinteänä faasina sopivalla pakkausmateriaalilla täytettyä kolonnia. |
| Mobiilivaihe | |
| Paperikromatografia | Juokseva liuotin on paperikromatografian liikkuva faasi. |
| Ohutkerroskromatografia | Juokseva liuotin on ohutkerroskromatografian liikkuva faasi. |
| Pylväskromatografia | Pesupuskuri on pylväskromatografian liikkuva faasi. |
| Erottelemiseen käytetyt mekanismit | |
| Paperikromatografia | Paperikromatografia perustuu kiinteän nesteen absorptioon. |
| Ohutkerroskromatografia | Ohutkerroskromatografia perustuu kiinteän nesteen absorptioon. |
| Pylväskromatografia | Pylväskromatografia perustuu koon poissulkemiseen, varaukseen ja muotoon. |
| Eluutiopuskuri | |
| Paperikromatografia | Ei vaadi paperikromatografiassa. |
| Ohutkerroskromatografia | Ei vaadita ohutkerroskromatografiassa. |
| Pylväskromatografia | Vaaditaan pylväskromatografiassa. |
| Havaitseminen | |
| Paperikromatografia | Värjäys ja retentiotekijän määrittäminen. |
| Ohutkerroskromatografia | Värjäys ja retentiotekijän määrittäminen. |
| Pylväskromatografia | Spektrofotometrinen määritys. |
Yhteenveto – Paperi ohut kerros vs pylväskromatografia
Paperikromatografia, TLC ja pylväskromatografia ovat erotustekniikoita, joita käytetään biomolekyylien, kuten proteiinien, aminohappojen ja hiilihydraattien (pääasiassa monosakkaridien) erottamiseen. Paperikromatografiassa käytetään kiinteänä faasina selluloosapaperia, ja erotusmekanismi perustuu kiinteä-neste-adsorptioon. TLC käyttää myös kiinteä-neste-adsorptiomekanismeja. Molekyylit erotetaan kiinteässä faasissa riippuen niiden liukoisuudesta liikkuvaan faasiin. Pylväskromatografia käyttää erottamiseen fysikaalisia ominaisuuksia, kuten kokoa, muotoa, varausta ja yhdisteen molekyylipainoa. Matriisimateriaalilla pakattu kolonni toimii stationaarifaasina, kun taas pesupuskuri toimii liuotinfaasina. Tämä on ero paperiohutkerroksen ja pylväskromatografian välillä.
