Avainero – NGS vs Sanger-sekvensointi
Next Generation Sequencing (NGS) ja Sanger Sequencing ovat kahden tyyppisiä nukleotidisekvensointitekniikoita, jotka on kehitetty ajan mittaan. Sanger Sekvensointimenetelmää käytettiin laaj alti vuosia ja NGS korvasi sen äskettäin sen etujen vuoksi. avainero NGS:n ja Sanger-sekvensoinnin välillä on se, että NGS toimii periaatteella sekvensoi miljoonia sekvenssejä samanaikaisesti nopeasti sekvensointijärjestelmän kautta, kun taas Sanger-sekvensointi toimii ketjun päättämisen periaatteella johtuen dideoksinukleotidien selektiivisestä sisällyttämisestä DNA-polymeraasientsyymiin. DNA-replikaation ja tuloksena olevan fragmentin erotuksen aikana kapillaarielektroforeesilla.
Mitä nukleotidisekvensointi on?
Geneettinen tieto on tallennettu organismin DNA:n tai RNA:n nukleotidisekvensseihin. Prosessi, jossa määritetään nukleotidien oikea järjestys (käyttäen neljää emästä) tietyssä fragmentissa (geenissä, geeniklusterissa, kromosomissa ja täydellisessä genomissa), tunnetaan nukleotidisekvensoinnina. Geenien rakenteen ja toiminnan analysointi on erittäin tärkeää genomitutkimuksissa, oikeuslääketieteellisissä tutkimuksissa, virologiassa, biologisessa systemaattisessa, lääketieteellisessä diagnoosissa, biotekniikassa ja monilla muilla aloilla. Tiedemiehet ovat kehittäneet erilaisia sekvensointimenetelmiä. Niistä Frederick Sangerin vuonna 1977 kehittämä Sanger-sekvensointi oli laaj alti käytössä ja suosituksi pitkän ajan, kunnes Next Generation Sequencing korvasi sen.
Mikä on NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) on termi, jota käytetään viittaamaan nykyaikaisiin suuren suorituskyvyn sekvensointiprosesseihin. Se kuvaa useita erilaisia moderneja sekvensointitekniikoita, jotka mullistavat genomitutkimukset ja molekyylibiologian. Nämä tekniikat ovat Illumina-sekvensointi, Roche 454 -sekvensointi, Ion Proton -sekvensointi ja SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) -sekvensointi. NGS-järjestelmät ovat nopeampia ja halvempia. NGS-järjestelmissä käytetään neljää pääasiallista DNA-sekvensointimenetelmää; pyrosekvensointi, sekvensointi synteesillä, sekvensointi ligaatiolla ja ionipuolijohdesekvensointi. Suuri määrä DNA- tai RNA-säikeitä (miljoonia) voidaan sekvensoida rinnakkain. Se mahdollistaa organismien koko genomin sekvensoinnin lyhyessä ajassa, toisin kuin Sangerin sekvensointi, joka vie enemmän aikaa.
NGS:llä on monia etuja verrattuna perinteiseen Sangerin sekvensointimenetelmään. Se on nopea, tarkempi ja kustannustehokkaampi prosessi, joka voidaan suorittaa pienellä otoskoolla. NGS:ää voidaan käyttää metagenomisissa tutkimuksissa, yksittäisen genomin sisältämien variaatioiden havaitsemisessa insertioista ja deleetioista jne. sekä geenien ilmentymien analysoinnissa.
Kuva_1: NGS-sekvensoinnin kehitys
Mitä Sanger-sekvensointi on?
Sanger Sekvensointi on Frederick Sangerin ja hänen kollegoidensa vuonna 1977 kehittämä sekvensointimenetelmä tietyn DNA-fragmentin tarkan nukleotidijärjestyksen määrittämiseksi. Se tunnetaan myös nimellä ketjun lopetussekvensointi tai dideoksisekvensointi. Tämän menetelmän toimintaperiaate on juostesynteesin lopettaminen sisällyttämällä selektiivisesti ketjun päättäviä dideoksinukleotideja (ddNTP:itä), kuten ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP DNA-polymeraasin toimesta DNA:n replikaation aikana. Normaaleissa nukleotideissä on 3' OH-ryhmät fosfodiesterisidoksen muodostamiseksi vierekkäisten nukleotidien välille juosteen muodostumisen jatkamiseksi. Kuitenkin ddNTP:iltä puuttuu tämä 3' OH-ryhmä, eivätkä ne pysty muodostamaan fosfodiesterisidoksia nukleotidien välille. Näin ollen ketjun venyminen loppuu.
Tässä menetelmässä sekvensoitava yksijuosteinen DNA toimii templaattijuosteena in vitro DNA-synteesiä varten. Muita vaatimuksia ovat oligonukleotidialuke, deoksinukleotidiprekursorit ja DNA-polymeraasientsyymi. Kun kohdefragmentin viereiset päät tunnetaan, alukkeet voidaan helposti suunnitella DNA-replikaatiota varten. Neljä erillistä DNA-synteesireaktiota suoritetaan neljässä erillisessä putkessa. Jokaisessa putkessa on erilliset ddNTP:t muiden vaatimusten ohella. Tietystä nukleotidista lisätään dNTP:iden ja ddNTP:iden seos. Samoin neljä erillistä reaktiota suoritetaan neljässä putkessa neljällä seoksella. Reaktioiden jälkeen suoritetaan DNA-fragmenttien havaitseminen ja fragmenttikuvion muuntaminen sekvenssiinformaatioksi. Tuloksena saadut DNA-fragmentit lämpödenaturoidaan ja erotetaan geelielektroforeesilla. Jos käytetään radioaktiivisia nukleotideja, polyakryyliamidigeelin juovakuvio voidaan visualisoida autoradiografialla. Kun tämä menetelmä käyttää fluoresoivasti merkittyjä dideoksinukleotideja, sitä voidaan lieventää geelilukeman aikana ja viedä lasersäteen läpi fluoresoivan ilmaisimen havaitsemiseksi. Jotta vältetään virheet, joita saattaa syntyä, kun sekvenssi luetaan silmällä ja syötetään manuaalisesti tietokoneeseen, tämä menetelmä kehitettiin automatisoidun sekvensserin käytöksi yhdistettynä tietokoneeseen.
Tällä menetelmällä sekvensoidaan DNA Human Genome -projektista. Tämä menetelmä on edelleen käytössä edistyneillä muokkauksilla, koska se antaa tarkat sekvenssitiedot, vaikka se on kallis ja hidas prosessi.
Kuva_2: Sanger-sekvensointi
Mitä eroa on NGS:n ja Sanger Sequencingin välillä?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) viittaa nykyaikaisiin suuren suorituskyvyn sekvensointiprosesseihin. Se kuvaa useita erilaisia moderneja sekvensointitekniikoita | Sanger Sekvensointi on Frederick Sangerin kehittämä sekvensointimenetelmä tietyn DNA-fragmentin tarkan nukleotidijärjestyksen määrittämiseksi. |
| Kustannustehokkuus | |
| NGS on halvempi prosessi, koska se vähentää aikaa, työvoimaa ja kemikaaleja. | Tämä on kallis prosessi, koska se vie aikaa, miesvoimaa ja enemmän kemikaaleja. |
| Nopeus | |
| Tämä on nopeampaa, koska sekä kemiallinen havaitseminen että signaalin havaitseminen monissa säikeissä tapahtuvat rinnakkain. | Tämä vie aikaa, koska kemiallinen havaitseminen ja signaalin havaitseminen tapahtuvat kahtena erillisenä prosessina ja vain säiettä voi lukea kerrallaan. |
| Luotettavuus | |
| NGS on luotettava. | Sanger-sekvensointi on vähemmän luotettava |
| Näytekoko | |
| NGS vaatii vähemmän DNA:ta. | Tämä menetelmä vaatii suuren määrän templaatti-DNA:ta. |
| DNA-emäkset sekvensoitua fragmenttia kohden | |
| DNA-emästen lukumäärä sekvensoitua fragmenttia kohti on pienempi kuin Sangerin menetelmä | Sekvenssien luominen on pidempi kuin NGS-sekvenssit. |
Yhteenveto – NGS vs Sanger Sequencing
NGS ja Sanger Sequencing ovat nukleotidisekvensointitekniikoita, joita käytetään laaj alti molekyylibiologiassa. Sanger-sekvensointi on varhainen sekvensointimenetelmä, joka korvattiin NGS:llä. Suurin ero NGS:n ja Sanger-sekvensoinnin välillä on, että NGS on nopea, tarkempi ja kustannustehokkaampi prosessi kuin Sanger-sekvensointi. Molemmat tekniikat loivat suuria epidemioita genetiikassa ja biotekniikassa.
