Avainero CRISPR:n ja restriktioentsyymien välillä on se, että CRISPR on luonnossa esiintyvä prokaryoottinen immuunipuolustusmekanismi, jota on viime aikoina käytetty eukaryoottisten geenien muokkaamiseen ja muokkaamiseen, kun taas restriktioentsyymit ovat biologisia saksia, jotka pilkkovat DNA-molekyylejä pienemmiksi aineiksi.
Genomin editointi ja geenien muuntaminen ovat mielenkiintoisia ja innovatiivisia genetiikan ja molekyylibiologian aloja. Geeniterapiatutkimuksissa käytetään laaj alti geenimuuntelua. Lisäksi geenimodifikaatiosta on hyötyä geenin ominaisuuksien, geenin toimivuuden ja geenin funktionaalisuuden tunnistamisessa ja sen, miten geenin mutaatiot voivat vaikuttaa sen toimintaan. On tärkeää saada tehokkaita ja luotettavia tapoja tehdä tarkkoja, kohdennettuja muutoksia elävien solujen genomiin. CRISPR- ja rajoitusentsyymeillä on keskeinen rooli geenimuunteluissa. CRISPR muokkaa geenejä suurella tarkkuudella. Restriktioentsyymit toimivat biologisina saksina, jotka pilkkovat DNA-molekyylejä pienemmiksi aineiksi.
Mikä on CRISPR?
CRISPR-järjestelmä on luonnollinen mekanismi, jota esiintyy joissakin bakteereissa, kuten E. colissa ja Archeassa. Se on adaptiivinen immuunisuoja vieraita DNA-pohjaisia tunkeutumisia vastaan. Lisäksi se on sekvenssispesifinen mekanismi. CRISPR-järjestelmä sisältää useita DNA-toistoelementtejä. Nämä elementit ovat välissä lyhyiden "välikesekvenssien" kanssa, jotka ovat peräisin vieraasta DNA:sta ja useista Cas-geeneistä. Jotkut Cas-geeneistä ovat nukleaaseja. Siten koko immuunijärjestelmää kutsutaan CRISPR/Cas-järjestelmäksi.
CRISPR/Cas-järjestelmä toimii neljässä vaiheessa:
- Järjestelmä, joka yhdistää geneettisesti tunkeutuvat faagi- ja plasmidi-DNA-segmentit (välikappaleet) CRISPR-lokuksiin (kutsutaan välikappaleen hankintavaiheeksi).
- crRNA-kypsymisvaihe – Isäntä transkriptoi ja prosessoi CRISPR-lokuksia kypsän CRISPR-RNA:n (crRNA) luomiseksi, joka sisältää sekä CRISPR-toistoelementtejä että integroidun välielementin.
- crRNA havaitsee homologiset DNA-sekvenssit komplementaarisella emäsparilla. Tämä on tärkeää, kun on olemassa infektio ja tartunnanaiheuttaja.
- Kohdehäiriövaihe – crRNA havaitsee vieraan DNA:n, muodostaa kompleksin vieraan DNA:n kanssa ja suojaa isäntää viera alta DNA:lta.
Tällä hetkellä CRISPR/Cas9-järjestelmää käytetään muuttamaan tai muokkaamaan nisäkkään genomia joko transkription repression tai aktivoinnin avulla. Nisäkässolut voivat reagoida CRISPR/Cas9-välitteisiin DNA-katkoihin ottamalla käyttöön korjausmekanismin. Se voidaan tehdä joko ei-homologisella pään liitosmenetelmällä (NHEJ) tai homologia-ohjatulla korjauksella (HDR). Molemmat korjausmekanismit tapahtuvat ottamalla käyttöön kaksisäikeisiä katkoja. Tämä johtaa nisäkäsgeenien muokkaamiseen. NHEJ voi johtaa geenimutaatioiden ablaatioon ja sitä voidaan käyttää toimintojen menettämiseen. HDR:ää voidaan käyttää spesifisten pistemutaatioiden tai eripituisten DNA-segmenttien tuomiseen. Tällä hetkellä CRISPR/Cas-järjestelmää käytetään terapeuttisissa, biolääketieteellisissä, maatalous- ja tutkimussovelluksissa.
Mitä ovat restriktioentsyymit?
Restriktioentsyymillä, jota kutsutaan yleisemmin restriktioendonukleaasiksi, on kyky pilkkoa DNA-molekyylejä pieniksi fragmenteiksi. Katkaisuprosessi tapahtuu lähellä tai erityisessä DNA-molekyylin tunnistuskohdassa, jota kutsutaan restriktiopaikaksi. Tunnistuspaikka koostuu tyypillisesti 4-8 emäsparista. Katkaisupaikasta riippuen restriktioentsyymejä voi olla neljää (04) eri tyyppiä: tyyppi I, tyyppi II, tyyppi III ja tyyppi IV. Muut tekijät kuin katkaisukohta, kuten koostumus, kofaktoreiden tarve ja kohdesekvenssin tila otetaan huomioon erotettaessa restriktioentsyymejä neljään ryhmään.
DNA-molekyylien pilkkomisen aikana katkaisukohta voi olla joko itse restriktiokohdassa tai etäisyyden päässä restriktiokohdasta. Restriktioentsyymit tekevät kaksi viiltoa DNA:n kaksoiskierteen sokeri-fosfaattirungon läpi.
Kuva 02: Restriktioentsyymit
Restriktioentsyymejä löytyy pääasiassa Achaeasta ja bakteereista. He käyttävät näitä entsyymejä puolustusmekanismina tunkeutuvia viruksia vastaan. Restriktioentsyymit pilkkovat vieraan (patogeenisen) DNA:n, mutta eivät omaa DNA:taan. Heidän omaa DNA:taan suojaa metyylitransferaasi-niminen entsyymi, joka tekee muutoksia isäntä-DNA:han ja estää pilkkoutumisen.
Tyypin I restriktioentsyymillä on katkaisukohta, joka on kaukana tunnistuskohdasta. Entsyymin toiminta vaatii ATP:tä ja proteiinia, S-adenosyyli-L-metioniinia. Tyypin I restriktioentsyymin katsotaan olevan monitoiminen, koska se sisältää sekä restriktio- että metylaasiaktiivisuuksia. Tyypin II restriktioentsyymit pilkkoutuvat itse tunnistuskohdassa tai lähempänä sitä. Se tarvitsee vain magnesiumia (Mg) toimiakseen. Tyypin II restriktioentsyymeillä on vain yksi tehtävä, ja ne ovat riippumattomia metylaasista.
Mitä yhtäläisyyksiä CRISPR:n ja restriktioentsyymien välillä on?
- CRISPR ja restriktioentsyymit ovat tärkeitä työkaluja geenimuuntelussa.
- Osa CRISPR:stä tai Cas9:stä ja restriktioentsyymeistä ovat endonukleaaseja.
- Molemmat voivat tunnistaa tunnusomaisia DNA-sekvenssejä ja katkaista DNA:n.
- Ne ovat bakteereissa ja arkeissa.
- Sekä CRISPR- että restriktioentsyymit ovat sekvenssispesifisiä.
Mitä eroa CRISPR:llä ja restriktioentsyymeillä on?
CRISPR-Cas-järjestelmä on prokaryoottinen immuunijärjestelmä, joka antaa vastustuskyvyn vieraille geneettisille elementeille. Toisa alta restriktioentsyymit ovat endonukleaaseja, jotka tunnistavat tietyn nukleotidisekvenssin ja tuottavat kaksijuosteisen leikkauksen DNA:han. Joten tämä on avainero CRISPR:n ja restriktioentsyymien välillä.
Lisäksi CRISPR- mahdollistaa erittäin tarkat leikkaukset. Siihen verrattuna restriktioentsyymikatkaisu on vähemmän tarkkaa. Lisäksi CRISPR on edistynyt tekniikka, kun taas restriktioentsyymit ovat primitiivisiä.
Alla infografiassa on yhteenveto CRISPR:n ja restriktioentsyymien eroista.
Yhteenveto – CRISPR vs restriktioentsyymit
CRISPR ja restriktioentsyymit ovat kahdenlaisia tekniikoita, joita käytetään geenimuuntelussa. CRISPR on adaptiivinen immuunisuojaus, joka toteutetaan joissakin bakteereissa vieraita DNA-pohjaisia invaasioita vastaan. Se on luonnollinen puolustusmekanismi. Sitä vastoin restriktioentsyymit ovat endonukleaaseja, jotka katkaisevat kaksijuosteista DNA:ta. Sekä CRISPR että restriktioentsyymit pystyvät leikkaamaan DNA:n pieniksi segmenteiksi. Molemmat ovat kuitenkin sekvenssikohtaisia. CRISPR:ään verrattuna restriktioentsyymit ovat primitiivisiä. CRISPR mahdollistaa erittäin tarkat leikkaukset kuin restriktioentsyymit. Joten tämä on yhteenveto CRISPR:n ja restriktioentsyymien välisestä erosta.
