Avainero – Sanger-sekvensointi vs pyrosekvensointi
DNA-sekvensointi on erittäin tärkeää DNA-analyysille, koska tieto oikean nukleotidien järjestelystä tietyllä DNA-alueella paljastaa monia tärkeitä tietoja siitä. On olemassa erilaisia DNA-sekvensointimenetelmiä. Sanger-sekvensointi ja pyrosekvensointi ovat kaksi erilaista DNA-sekvensointimenetelmää, joita käytetään laaj alti molekyylibiologiassa. avainero Sanger-sekvensoinnin ja pyrosekvensoinnin välillä on se, että Sanger-sekvensointi käyttää dideoksinukleotidejä DNA-synteesin lopettamiseen nukleotidisekvenssin lukemiseksi, kun taas pyrosekvensointi havaitsee pyrofosfaatin vapautumisen sisällyttämällä nukleotidit ja syntetisoimalla komplementaarisen sekvenssin sekvenssin tarkan järjestyksen lukemiseksi.
Mitä Sanger-sekvensointi on?
Sanger-sekvensointi on Frederick Sangerin ja hänen korkeakoulunsa vuonna 1977 kehittämä ensimmäisen sukupolven DNA-sekvensointimenetelmä. Se tunnetaan myös nimellä Chain Termination Sequencing tai Dideoxy-sekvensointi, koska se perustuu ketjun päättämiseen dideoksinukleotidien (ddNTP) avulla. Tätä menetelmää käytettiin laaj alti yli 30 vuoden ajan, kunnes uuden sukupolven sekvensointi (NGS) kehitettiin. Sangerin sekvensointitekniikka mahdollisti oikean nukleotidijärjestyksen löytämisen tai tietyn DNA-fragmentin kiinnittymisen. Se perustuu ddNTP:iden selektiiviseen sisällyttämiseen ja DNA-synteesin lopettamiseen DNA:n in vitro -replikaation aikana. 3'-OH-ryhmien puuttuminen fosfodiesterisidoksen muodostumisen jatkamiseksi vierekkäisten nukleotidien välillä on ddNTP:iden ainutlaatuinen ominaisuus. Siten, kun ddNTP on kiinnitetty, ketjun venyminen lakkaa ja päättyy tästä pisteestä. Sanger-sekvensoinnissa käytetään neljää ddNTP:tä – ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Nämä nukleotidit pysäyttävät DNA:n replikaatioprosessin, kun ne liitetään kasvavaan DNA-juosteeseen ja johtavat vaihtelevan pituisiin lyhyisiin DNA:han. Kapillaarigeelielektroforeesia käytetään näiden lyhyiden DNA-säikeiden järjestämiseen niiden koon mukaan geelissä kuvan 01 mukaisesti.
Kuva 1: Syntetisoidun lyhyen DNA:n kapillaarigeelielektroforeesi
DNA:n in vitro -replikaatiolle on vain vähän vaatimuksia. Ne ovat DNA-polymeraasientsyymi, templaatti-DNA, oligonukleotidialukkeet ja deoksinukleotidit (dNTP:t). Sanger-sekvensoinnissa DNA-replikaatio suoritetaan neljässä erillisessä koeputkessa sekä neljän tyyppisessä ddNTP:ssä erikseen. Deoksinukleotidit eivät ole täysin korvattuja vastaavilla ddNTP:illä. Tietyn dNTP:n seos (esimerkiksi dATP + ddATP) sisällytetään putkeen ja replikoidaan. Neljää erillistä putkituotetta ajetaan geelillä neljässä erillisessä kaivossa. Sitten lukemalla geelin sekvenssi voidaan muodostaa kuvan 02 mukaisesti.
Kuva 02: Sanger-sekvensointi
Sanger-sekvensointi on tärkeä tekniikka, joka auttaa monilla molekyylibiologian aloilla. Ihmisen genomiprojekti saatiin onnistuneesti päätökseen Sangerin sekvensointiin perustuvien menetelmien avulla. Sanger-sekvensointi on hyödyllinen myös kohde-DNA:n sekvensoinnissa, syövän ja geneettisten sairauksien tutkimuksessa, geeniekspressioanalyysissä, ihmisen tunnistamisessa, patogeenien havaitsemisessa, mikrobisekvensoinnissa jne.
Sanger-sekvensoinnissa on useita haittoja:
- Sekvensoitavan DNA:n pituus ei voi olla pidempi kuin 1000 emäsparia
- Vain yksi säie voidaan sekvensoida kerrallaan.
- Prosessi on aikaa vievä ja kallis.
Siksi uusia edistyneitä sekvensointitekniikoita kehitettiin ajan myötä näiden ongelmien voittamiseksi. Sanger-sekvensointi on kuitenkin edelleen käytössä, koska sen tulokset ovat erittäin tarkkoja, jopa noin 850 emäsparin pituisia fragmentteja.
Mitä pyrosekvensointi on?
Pyrosequencing on uusi DNA-sekvensointitekniikka, joka perustuu "sekvensointiin synteesillä". Tämä tekniikka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä. Prosessia käyttävät neljä erilaista entsyymiä: DNA-polymeraasi, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja apyraasi sekä kaksi substraattia, adenosiini-5'-fosfosulfaatti (APS) ja lusiferiini.
Prosessi alkaa alukkeen sitoutumisesta yksijuosteiseen DNA-templaattiin ja DNA-polymeraasi aloittaa sitä täydentävien nukleotidien liittämisen. Kun nukleotidit liittyvät yhteen (nukleiinihappopolymerointi), se vapauttaa pyrofosfaattiryhmiä (kaksi fosfaattiryhmää sitoutunut yhteen) ja energiaa. Jokainen nukleotidilisäys vapauttaa ekvimolaarisen määrän pyrofosfaattia. Pyrofosfaatti muuttuu ATP:ksi ATP-sulfurylaasin vaikutuksesta substraatin APS läsnä ollessa. Muodostunut ATP ohjaa lusiferaasivälitteistä lusiferiinin muuntamista oksilusiferiiniksi tuottaen näkyvää valoa määrinä, jotka ovat verrannollisia ATP:iden määrään. Valo havaitaan fotonien havaitsemislaitteella tai valon monistimella ja luo pyrogrammin. Apyraasi hajottaa ATP:tä ja inkorporoitumattomia dNTP:itä reaktioseokseen. dNTP-lisäys tehdään kerran kerrallaan. Koska nukleotidin lisääminen tunnetaan valon sisällyttämisen ja havaitsemisen perusteella, templaatin sekvenssi voidaan määrittää. Pyrogrammia käytetään näyte-DNA:n nukleotidisekvenssin luomiseen kuvan 03 mukaisesti.
Pyrosekvensointi on erittäin tärkeä yhden nukleotidin polymorfismianalyysissä ja lyhyiden DNA-osien sekvensoinnissa. Suuri tarkkuus, joustavuus, automaation helppous ja rinnakkaiskäsittely ovat pyrosekvensoinnin etuja Sanger-sekvensointitekniikoihin verrattuna.
Kuva 03: Pyrosekvensointi
Mitä eroa on Sanger-sekvenssin ja pyrosekvensoinnin välillä?
Sangerin sekvensointi vs pyrosekvensointi |
|
| Sanger-sekvensointi on DNA-sekvensointimenetelmä, joka perustuu ddNTP:iden selektiiviseen sisällyttämiseen DNA-polymeraasin ja ketjun lopettamisen avulla. | Pyrosekvensointi on DNA:n sekvensointimenetelmä, joka perustuu pyrofosfaatin vapautumisen havaitsemiseen nukleotidin sisällyttämisen yhteydessä. |
| ddNTP:n käyttö | |
| ddNTP:itä käytetään DNA:n replikaation lopettamiseen | ddNTP:itä ei käytetä. |
| Entsyymit mukana | |
| DNA-polymeraasia käytetään. | Käytetään neljää entsyymiä: DNA-polymeraasi, ATP-sulfurylaasi, lusiferaasi ja apyraasi. |
| Käytetyt substraatit | |
| APS ja Luciferin eivät ole käytössä. | Adenosiini 5' fosfosulfaattia (APS) ja lusiferiiniä käytetään. |
| Maksimilämpötila | |
| Tämä on hidas prosessi. | Tämä on nopea prosessi. |
Yhteenveto – Sangerin sekvensointi vs pyrosekvensointi
Sanger-sekvensointi ja Pyrosequencing ovat kaksi molekyylibiologiassa käytettyä DNA-sekvensointimenetelmää. Sanger-sekvensointi rakentaa nukleotidien järjestyksen sekvenssissä lopettamalla ketjun pidentymisen, kun taas pyrosekvensointi konstruoi nukleotidien tarkan järjestyksen sekvenssissä sisällyttämällä nukleotideja ja havaitsemalla pyrofosfaattien vapautumisen. Siksi tärkein ero Sanger-sekvensoinnin ja pyrosekvensoinnin välillä on se, että Sanger-sekvensointi toimii sekvensoimalla ketjun päättämisellä, kun taas pyrosekvensointi toimii sekvensoimalla synteesillä.
