Avainero – kloonaus vs. alakloonaus
Kloonaus ja subkloonaus ovat molekyylibiologisia toimenpiteitä, joilla luodaan geneettisesti identtisiä soluja tai organismeja, joissa on kiinnostava DNA tai geeni. Kloonaus on tekniikka, joka sisältää kiinnostuneen geenin tai DNA:n liittämisen vektoriin, sen replikoinnin isäntäbakteerissa ja sellaisten solujen tai organismien tuottamisen, jotka ovat tarkkoja kopioita geneettisestä rakenteesta. Subkloonaus on tekniikka, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin, joka on jo insertoitu vektoriin, liittämisen sekundaariseen vektoriin, sen replikoitumisen isäntäbakteerissa ja geneettisesti identtisten kopioiden tuottamisen soluista tai organismeista.keskeinen ero kloonauksen ja alakloonauksen välillä on, että kloonauksessa kiinnostuksen kohteena oleva geeni, kun se on ligatoitu vektoriin, jatkaa kloonausprosessia, kun taas subkloonauksessa jo kloonattu kiinnostuksen kohteena oleva geeni erotetaan emovektorista ja liitetään uudelleen vastaanottajavektori ja jatka prosessia.
Mitä on kloonaus?
Kloonaus on menetelmä, joka tuottaa geneettisesti identtisiä organismeja tai soluja. Luonnossa kloonaus tapahtuu aseksuaalisen lisääntymisen keinoin. Kun geneettistä rekombinaatiota tai muutosta ei tapahdu, tytärsolut saavat saman geneettisen rakenteen kuin vanhemman. Prokaryoottiset ja eukaryoottiset organismit luovat klooneja binäärifission, silmujen, mitoosin jne. avulla. Molekyylibiologiassa geenien tai tiettyjen DNA-fragmenttien kloonaus on suosittu menetelmä kyseisen DNA-osan rakenteen ja toiminnan tutkimiseksi.
Molekulaarisen kloonauksen päätavoitteena on tehdä miljoonia kopioita geneettisesti identtisistä soluista tai organismeista, joissa on kiinnostava DNA-fragmentti (pääasiassa geenejä). Se luo organismeja, joilla on tarkat geneettiset kopiot toisesta. Ensisijaisesti spesifisiä geenejä kloonataan molekyylitutkimuksissa rakenteellisen ja toiminnallisen tiedon saamiseksi ja DNA-sekvensointia varten. Kloonausta käytetään myös laaj alti tiettyjen proteiinien tai tuotteiden tuotannossa suuressa mittakaavassa.
Kloonausmenettely
Kloonauksen perusvaiheet ovat seuraavat.
- Kiinnostavan geenin tunnistaminen ja eristäminen. (Kiinnostavan geenin monistus PCR:llä).
- Kiinnostavan geenin restriktiohajotus (restriktioendonukleaasi leikkaa geenin).
- Vektori-DNA:n restriktiohajotus. (Vektori-DNA leikataan myös käyttämällä samaa restriktioendonukleaasia).
- Geenin lisääminen vektoriin ja rekombinanttimolekyylin muodostuminen.
- Rekombinanttivektorin muuntaminen isäntäbakteeriksi.
- Transformoituneiden bakteerien eristäminen ja tunnistaminen (plasmidivektorin tulee sisältää selektoitavissa oleva geeni, yleisimmin antibioottiresistenssigeeni transformoituneiden bakteerien seulomiseksi).
- Rekombinanttigeenin ilmentyminen isännässä.
Kuva_01: Kloonausmenettely
Mitä on alikloonaus?
Subkloonaus on toimenpide, jolla siirretään kiinnostuksen kohteena oleva geeni yhdestä vektorista toiseen, jotta nähdään geenin ilmentyminen geenin halutun toiminnallisuuden saavuttamiseksi. Tässä menetelmässä on mukana kaksi vektoria; nimittäin emovektori ja kohdevektori. Kloonatut insertit siirretään uudelleen toiseen vektoriin alakloonauksessa. Geenin siirtämisen ensimmäisestä vektorista toiseen vektoriin tavoitteena on saada jotain, mitä ensimmäinen vektori ei voinut tehdä, tai erottaa geeni uudelleen jo kloonatusta DNA-fragmentista ja ekspressoida sitä yksin. Tässä menettelyssä käytetään alussa restriktioentsyymejä.
Alikloonausmenettely
Alikloonauksen perusvaiheet ovat seuraavat.
- Restriktioendonukleaasien avulla halutun DNA:n erottaminen luovuttajaplasmidista (emovektori).
- Kiinnostavan DNA:n monistus PCR:llä.
- PCR-tuotteen (kiinnostavan DNA:n) puhdistus geelielektroforeesilla.
- Vastaanottajaplasmidin avaaminen samoilla restriktioendonukleaaseilla, joita käytettiin kiinnostavan DNA:n erottamiseen emoplasmidista.
- Kiinnostavan DNA:n (geenin) ligaatio vastaanottajaplasmidiin subkloonatun plasmidin luomiseksi.
- Alikloonatun vektorin muuntaminen päteväksi isäntäbakteeriksi.
- Muunnettujen solujen seulonta.
- Plasmidi-DNA:n puhdistus ja käyttö DNA:n sekvensointiin tai geenien ilmentämiseen haluttujen tuotteiden saamiseksi.
Alikloonaus suoritetaan silloin, kun yksi geeni eristetään kloonatusta geeniryhmästä tai kun kiinnostuksen kohteena oleva geeni on siirrettävä käyttökelpoiseen plasmidiin, jotta voidaan nähdä kiinnostavan geenin tarkka toiminta.
Kuva_02: Alakloonaus
Mitä eroa on kloonauksella ja alakloonauksella?
Kloonaus vs. alakloonaus |
|
| Kloonaus on menetelmä, joka tuottaa geneettisesti identtisiä organismeja tai soluja. | Subkloonaus on toimenpide, jolla siirretään kiinnostava geeni yhdestä vektorista toiseen nähdäkseen geenin ilmentymisen geenin halutun toiminnallisuuden saavuttamiseksi. |
| Prosessi | |
| Ero mielenkiinnon kohteena oleva DNA organismista ja liitetään vektoriin kerran ja kloonataan | Jo kloonattu DNA erotetaan ensimmäisestä vektorista ja liitetään toiseen vektoriin ja kloonataan. |
| Lisää liike vektorien kautta | |
| Ei siirrä inserttejä (kiinnostavaa DNA:ta) vektorista toiseen. | Siirrä lisäykset päävektorista kohdevektoriin. |
Yhteenveto – Kloonaus vs. alakloonaus
Kloonaus luo geneettisesti identtisiä soluja tai organismeja, joihin on lisätty kiinnostava geeni tai DNA. Se etenee kiinnostuksen kohteena olevan DNA:n erottamisen ja liittämisen kautta vektoriin ja ilmentymisen kautta isäntäbakteerin sisällä. Subkloonauksessa on samanlaisia vaiheita kuin kloonauksessa. Subkloonauksessa jo kloonattu DNA-fragmentti (kiinnostava geeni) insertoidaan kuitenkin vektoriin ja transformoidaan isäntäbakteeriksi. Se on keskeinen ero kloonauksen ja alakloonauksen välillä.
