Avainero – tylppä vs tahmea päätysidonta
Restriktioendonukleaasit ovat spesifisiä entsyymejä, jotka leikkaavat kaksijuosteista DNA:ta (dsDNA). Molekyylibiologiassa ne tunnetaan myös molekyylisaksina. Restriktioentsyymit pystyvät tunnistamaan spesifisiä lyhyitä dsDNA:n sekvenssejä, jotka tunnetaan tunnistuskohtina, ja katkaisevat fosfodiesteri- ja vetysidoksia avatakseen kaksoisjuosteita. Näiden entsyymien aiheuttaman katkaisun seurauksena syntyy DNA-fragmentteja, joissa on erityyppiset päät, kuten tahmeat ja tylpät päät. DNA-ligaasi on entsyymi, jota käytetään molekyylibiologiassa yhdistämään kaksi vierekkäistä DNA-juostetta muodostamalla uusia sidoksia. Vaihe tunnetaan ligaationa, ja ligatoidun DNA-pään tyypin mukaan niitä voidaan kutsua tylppäpään ligaatioksi ja tahmean pään ligaatioksi. avainero tylpän ja tahmean pään ligaation välillä on, että tylppän pään ligaatio tapahtuu DNA-fragmenttien välillä, jotka sisältävät kaksi tylppäpäätä, kun taas tahmean pään ligaatio tapahtuu 5'- ja 3'-ylitysten välillä. Verrattuna tylppään pään sidomiseen, tahmean pään sidonta on tehokkaampaa ja vakaampaa.
Mikä on tylppäpää?
Jotkin restriktioendonukleaasit voivat leikata DNA:n vastakkaisista emäksistä ja tuottaa tylppäpäisiä DNA-fragmentteja. Nämä entsyymit tunnetaan tylppäpään leikkureina; ne lohkeavat suoraan alas restriktiokohdan keskelle jättämättä yksijuosteisia ulkonevia emäksiä. Tylsät päät tunnetaan myös ei-ylityspäinä, koska niiden päissä ei ole 3' ja 5' ulkonevia pohjaja. Molemmat säikeet päättyvät emäspareista tylpäihin päihin. Yleisiä tylppäpäiden leikkaavia entsyymejä ovat EcoRV HaeIII, AluI ja Smal.
Tylppän pään sidos on mukana kahden tylpän pään välillä. Se ei ole ulkonevien emästen sidontaa. Tämä sidonta on vähemmän tehokasta kuin tahmeapään sidonta. Kuitenkin joissakin tapauksissa tylpän pään ligaatiosta tulee edullisempaa kuin tahmean pään ligaatiosta, erityisesti kun ligatoidaan PCR-tuotteita. PCR-tuotteet valmistetaan aina tylpäillä päillä. Tylppäpään ligaatio ei vaadi komplementaarisia päitä DNA:ssa ligaatiota varten.
Kuva 01: Tylsä lopputuotanto Eco RV -entsyymillä
Mikä on Sticky End -ligaatio?
Jotkut restriktioendonukleaasit pystyvät leikkaamaan dsDNA:ta jättäen päähän ulkonevan osan yksijuosteista DNA:ta. Nämä päät tunnetaan tahmeina tai ulkonevina päinä. Tarttuvan pään ligaatio tapahtuu kahden DNA-fragmentin välillä, jotka sisältävät yhteensopivia ulokkeita, koska tahmeissa päissä on parittomia emäksiä ja ne vaativat komplementaarisia emäksiä sidosten muodostamiseksi. Tästä syystä on välttämätöntä käyttää samaa restriktioentsyymiä molemmille DNA-lähteille sopivien ligatointifragmenttien tuottamiseksi.
Tahmepään ligaatio on tehokkaampaa ja usein erittäin toivottavaa kloonausprosesseissa. On olemassa useita restriktioentsyymejä, jotka tuottavat tahmeita päitä. Ne ovat EcoRI, BamHI, HindIII jne.
Kuva 02: Eco RI -entsyymin tahmea lopputuotanto
Mitä eroa on tylppä ja tarttuvan pään ligaation välillä?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Tylppään pään ligaatio tapahtuu kahden tylppäpään DNA-fragmentin välillä. | Tahmepään ligaatio tapahtuu kahden yhteensopivan DNA-fragmentin välillä, joilla on tahmea pää. |
| Entsyymit | |
| Tylkät päät tekevät tylsät päät. | Tahmeilla päätyleikkureilla saadaan tahmeita tai yhtenäisiä päitä. |
| Vaatimus päiden täsmäämisestä | |
| Se ei vaadi yhteensopivia fragmentteja tai täydentäviä emäksiä. | Se vaatii täydentäviä emäksiä päissä emäsparien muodostamiseksi. |
| Tehokkuus | |
| Se on vähemmän tehokas kuin tahmean pään sidonta | Se on tehokkaampi kuin tylppäpään sidonta. |
Yhteenveto – Blunt vs Sticky End ligaation
Restriktioendonukleaasit pystyvät pilkkomaan dsDNA:ta ja tuottamaan DNA-fragmentteja, joilla on eri päitä. Ne tunnistavat spesifisiä sekvenssejä ja rajoittavat DNA:ta luoden tahmeita ja tylsiä päitä. Tahmeissa päissä on parittomat emäkset fragmenttien päässä. Tylsät päät syntyvät suoran halkeaman ansiosta ja niiden päissä on emäsparit. Tahmapään ligaatio vaatii kaksi komplementaarista yksijuosteista DNA-palaa. Tylsän pään ligaatio tapahtuu minkä tahansa kahden tylpän pään fragmentin välillä. Tämä on ero tylsän ja tahmean ligaation välillä.
