Avainero – SDS-sivu vs natiivisivu
SDS ja natiivisivu ovat kahdenlaisia polyakryyliamidigeelielektroforeesitekniikoita, joita käytetään molekyylibiologiassa. Tärkein ero SDS-sivun ja alkuperäissivun välillä on käytetyn polyakryyliamidigeelin tyyppi. SDS-sivulla käytetään denaturoivaa geeliä, joten molekyylit erotetaan niiden molekyylipainon perusteella. Sitä vastoin Native Pagessa käytetään ei-denaturoivia geelejä. Siksi molekyylit erotetaan niiden koon, varauksen ja muodon perusteella.
Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (Page) käyttää geeliä, joka on valmistettu polymeroimalla akryyliamidimonomeerit metyleenibisakryyliamidilla. Polyakryyliamidi on sitkeämpää ja lämmönkestävämpää kuin agaroosi. Polyakryyliamidigeeleissä on pienempi huokoskoko, mikä mahdollistaa proteiinien tehokkaan erottamisen. Sivun asetuksia on kahta päätyyppiä, nimittäin SDS-sivu ja alkuperäinen sivu. SDS Page tai natrium-dodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi erottaa proteiinit niiden molekyylipainojen perusteella. SDS-sivulla käytetään denaturoivia geelejä. Native Page käyttää ei-denaturoivia geelejä ja erottaa proteiinit niiden koon, varauksen ja muodon (3D-rakenteen) perusteella.
Mikä on SDS-sivu?
SDS-sivu on yleisin elektroforeettinen tekniikka, jota käytetään proteiinien erottamiseen niiden molekyylipainon perusteella. Geeli valmistetaan lisäämällä SDS:ää (natriumdodekyylisulfaattia), joka on pesuaine. SDS tekee proteesiproteesit monomeereiksi. SDS on anioninen pesuaine. Siksi se lisää negatiivisen nettovarauksen proteiineihin laajalla pH-alueella. Kun negatiivinen nettovaraus välittyy proteiinimolekyyleihin, varauksen vaihtelun vuoksi monimutkaiset rakenteet hajoavat. Negatiivisen varauksen ansiosta proteiinit vetävät puoleensa positiivista päätä kohti. Siten pienemmän molekyylipainon omaavat molekyylit kulkevat nopeammin geelimatriisissa ja ne voidaan havaita lähellä anodia, kun taas suuremman molekyylipainon omaavat proteiinit havaitaan lähempänä kuoppia.
Kuva 01: SDS-sivu
SDS:n sitoutuminen polypeptidiketjuun on verrannollinen sen suhteelliseen molekyylimassaan. Siksi molekyylimassa voidaan määrittää myös SDS-sivun kautta. SDS Page -geelien värjäys tehdään bromifenolisinivärjäyksellä. SDS-sivun sovellukset vaihtelevat laajemmin, missä sillä voidaan arvioida suhteellista molekyylimassaa ja määrittää proteiinien suhteellinen runsaus proteiiniseoksessa. SDS-sivua voidaan käyttää myös proteiinien jakautumisen määrittämiseen proteiiniseoksessa. SDS-sivua käytetään myös proteiinien puhdistamiseen ja arviointiin. Sitä käytetään alustavana menetelmänä Western blot -analyysissä ja hybridisaatiossa, jota puolestaan käytetään proteiinien kartoittamiseen ja tunnistamiseen.
Mikä on natiivisivu?
Native polyakryyliamidigeelielektroforeesi (Native Page) käyttää ei-denaturoivaa geeliä. Siksi SDS:ää tai muuta denaturoivaa ainetta ei lisätä geelimatriisiin. Native Pagessa proteiinien erottelu perustuu proteiinin varaukseen ja kokoon. Siksi proteiinin liikkuvuus riippuu varauksesta ja proteiinin koosta.
Proteiinin varaus riippuu aminohappojen sivuketjuista. Jos sivuketjut ovat negatiivisesti varautuneita, proteiini saa negatiivisen kokonaisvarauksen ja päinvastoin. Proteiinit säilyttävät 3D-rakenteen tapahtuvan laskostumisen ansiosta. Taittuminen johtuu useista sidostyypeistä proteiineissa, kuten disulfidisidoksesta, hydrofobisista vuorovaikutuksista ja vetysidoksista. Siksi, jos alkuperäistä sivua kuljetetaan neutraalissa pH:ssa, proteiinit erotetaan proteiinin molekyylimuodon mukaan. Siksi alkuperäistä sivua voidaan käyttää herkänä tekniikkana proteiinin varauksen tai konformaation muutoksen havaitsemiseen.
Natiivisivun tärkein etu on, että Sivu-analyysiin käytetty proteiini voidaan palauttaa alkuperäisessä tilassaan Sivu-analyysin jälkeen, koska proteiinia ei häiritä prosessin aikana. Native Page on suhteellisen korkean suorituskyvyn tekniikka, ja proteiinin stabiilisuus on lisääntynyt.
Kuva 02: Alkuperäinen sivu
Geeliajon päätyttyä Native Page -geeliä voidaan tarkastella värjäämällä bromifenolisinisellä tai millä tahansa muulla sopivalla värjäysreagenssilla. Native Page -sovelluksen sovelluksia ovat happamien proteiinien, mukaan lukien glykoproteiinien, kuten ihmisen rekombinanttierytropoietiinin, erottaminen tai naudan seerumialbumiinissa (BSA) olevien proteiinien tunnistaminen.
Mitä yhtäläisyyksiä SDS-sivun ja alkuperäissivun välillä on?
- Sekä SDS Page että Native Page -järjestelmät käyttävät polyakryyliamidigeeliä geelin matriisina.
- Molempia käytetään proteiinien erottamiseen ja tunnistamiseen.
- Molemmat käyttävät elektroforeettista liikkuvuutta yhdisteiden erottamiseen.
- Molemmat voidaan tehdä pysty- tai vaakasuunnassa (useimmiten pystysuuntaisina sivuasetuksina, koska ajon pituus on enemmän).
- Molempien tekniikoiden toimintaan tarvitaan elektroforeesilaitteisto, mukaan lukien geelisäiliö, kammat ja virtalähde.
- Geelin visualisointi voidaan tehdä värjäysmenetelmillä molemmissa tekniikoissa.
Mitä eroa SDS-sivulla ja alkuperäissivulla on?
SDS-sivu vs natiivisivu |
|
| SDS-sivu tai natriumdodekyylisulfaattisivu erottaa proteiinit niiden molekyylipainon perusteella ja käyttää denaturoivaa geeliä. | Native Page käyttää ei-denaturoivia geelejä ja erottaa proteiinit niiden koon, varauksen ja muodon (3D-rakenteen) perusteella. |
| Geelityyppi | |
| SDS-sivulla käytetään denaturoivaa geeliä. | Alkusivulla on käytetty ei-denaturoivaa geeliä. |
| SDS:n läsnäolo | |
| SDS on mukana pesuaineena, joka antaa negatiivisen varauksen näytteeseen SDS-sivulla. | SDS ei ole natiivisivulla. |
| Erotteluperuste | |
| Proteiinien erottelu riippuu proteiinin molekyylipainosta SDS-sivulla. | Erotus riippuu alkuperäissivun proteiinimolekyylin koosta ja muodosta. |
| Proteiinin vakaus | |
| Proteiinin vakaus on alhainen SDS-sivulla. | Proteiinin vakaus on korkea alkuperäisellä sivulla. |
| Alkuperäisen proteiinin t alteenotto | |
| Ei mahdollista, koska se on denaturoitu SDS-sivulla. | Mahdollista alkuperäisellä sivulla. |
Yhteenveto – SDS-sivu vs natiivisivu
SDS Page ja Native Page ovat kahden tyyppisiä polyakryyliamidigeelielektroforeesitekniikoita, joita käytetään proteiinien erottamiseen. SDS-sivu käsitellään SDS-nimisellä pesuaineella. SDS antaa proteiinille negatiivisen kokonaisvarauksen, joka sitten johtaa proteiinin denaturoitumiseen. Siksi proteiinit erotetaan niiden molekyylipainon perusteella. Sitä vastoin Native Page -tekniikka ei käytä denaturoivaa ainetta. Siten proteiinit joko erotetaan niiden koon tai muodon perusteella. Tämä on ero SDS-sivun ja natiivisivun välillä.
